[发明专利]通过质谱法测定BRAF突变和野生型BRAF蛋白的方法

权利要求书

1.丝氨酸蛋白酶在制备用于测定生物样品中野生型BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的剂中的用途，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，其中所述BRAF蛋白变体是在对应于野生型BRAF中第600位氨基酸的位置上突变的变体，所述位置在所述野生型BRAF中为缬氨酸，其中测定野生型BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比包括以下步骤：

a）通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含通过所述蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型B-raf蛋白与BRAF蛋白变体之间不同；

b）使用质谱技术定量测定消化野生型B-raf蛋白产生的肽片段的摩尔量和消化所述野生型B-raf蛋白的变体产生的肽片段的摩尔量；以及

c）基于定量评估，计算所述野生型BRAF蛋白与其变体之间的至少一个具体比值。

2. 权利要求1的用途，其中所述BRAF蛋白变体是BRAF V600E、V600D、V600R和/或V600K。

3.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述丝氨酸蛋白酶是谷氨酰内肽酶。

4.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述消化步骤包括用乙酸铵、碳酸氢铵和/或磷酸盐缓冲液处理所述样品。

5.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述样品是肿瘤组织样品或体液。

6.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述样品是肿瘤组织，所述肿瘤组织是来自恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑肿瘤癌、低级神经胶质瘤或卵巢癌肿瘤的组织。

7. 权利要求1或2中任一项的用途，其中由消化所述定量评估步骤中使用的野生型B-raf蛋白产生的多肽片段是根据SEQ ID 1和/或SEQ ID 8的多肽。

8. 权利要求2的用途，由消化所述定量评估步骤中测量的所述野生型B-raf蛋白的蛋白变体产生的多肽片段是根据SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5、SEQ ID 6、SEQ ID7、SEQ ID 9和/或SEQ ID 10的多肽。

9.权利要求1或2中任一项的用途，其中所述质谱技术是与质谱技术连接的液相色谱。

10.权利要求9的用途，其中所述与质谱技术连接的质谱液相色谱是HPLC/ESI-MS。

11.丝氨酸蛋白酶在制备用于评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性的剂中的用途，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C-端切割成谷氨酸残基或将肽键C-端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，其中评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性包括以下步骤：

（i）提供来自患有BRAF相关疾病的受试者的样品；以及通过根据权利要求1至8中任一项的方法测定野生型BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比；

（ii）将野生型BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比与野生型BRAF蛋白与其变体之间的具体摩尔比的参考值进行比较，所述参考值是由来自已知患有所述BRAF相关疾病并对所述给定药物治疗敏感的受试者的大量样品测定的；

（iii）基于所述比较，确定所述受试者对给定药物治疗的敏感性，

其中所述样品中野生型BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值高于野生型BRAF与所述至少一种BRAF蛋白变体的比值参考值表示对给定药物治疗的敏感性增加。

12.权利要求11的用途，其中所述药物治疗是使用激酶抑制剂如维莫非尼、达拉非尼或索拉非尼进行治疗。