[发明专利]用于血红蛋白β和镰状血红蛋白β的质谱标准及其用途

说明书

本文提供了用于区别血红蛋白β(HBB)和镰状血红蛋白β(HBS)的质谱标准，以及使用这些标准确定样品中HBB相对于HBS的量的方法。

本申请案要求2016年12月19日提交的美国临时申请第62/435,948号的优先权，该临时申请特此通过引用整体并入。

发明背景

镰状细胞贫血由β-珠蛋白基因的单核苷酸多态性而引起。多态性导致在血红蛋白β蛋白(HBB)的氨基酸序列上的位置7处谷氨酸残基被缬氨酸残基取代。第七位处的谷氨酸被缬氨酸取代的HBB称为镰状血红蛋白β蛋白(HBS)。所有人都有两个拷贝的β珠蛋白基因，只有这两个β-珠蛋白基因都具有镰状细胞突变的个体才患有镰状细胞贫血。目前尚未鉴定出能在功能上治愈这种突变的药物治疗剂，但是将缺乏这种突变的造血祖细胞手术移植到镰状细胞患者中已经成功地治疗了镰状细胞患者。进一步地，这些研究已经证明，由于人血液中HBB的半衰期较长，仅需要用HBB置换一部分HBS蛋白。

发明内容

随着干细胞技术和基因矫正技术的进步，在对患者进行调理之前确定需要在矫正细胞中产生的最小HBB/HBS比率至关重要。因此，本文提供了评价经基因修饰的溶血产物样品中镰状细胞突变的矫正水平的方法。所述方法包括(a)将所述样品与胰蛋白酶一起温育以获得血红蛋白片段，其中所述血红蛋白片段包含HBB和HBS肽；(b)通过液相色谱法对经胰蛋白酶处理的样品中的HBB和HBS肽与其它组分进行色谱分离；以及(c)通过质谱法分析经色谱分离的HBB和HBS肽以确定所述溶血产物样品中的HBB/HBS比率，其中HBB/HBS比率是通过比较步骤(c)的质谱结果与标准曲线来确定的，所述标准曲线是由已知比率的包含SEQID NO:1(VHLTPEEKS)的合成HBB肽与包含SEQ ID NO:2(VHLTPVEKS)的合成HBS肽的胰蛋白酶消化物的质谱结果生成的。

还提供了确定包含多个经基因修饰的造血干细胞的造血干细胞群是否会有效减轻受试者中镰状细胞疾病的一种或多种症状的方法，所述经基因修饰的造血干细胞在编码血红蛋白的基因组序列上具有经矫正的镰状细胞突变。所述方法包括(a)使所述造血干细胞群的第一亚群分化成红细胞；(b)保存所述造血干细胞群的第二亚群；(c)由所述红细胞获得溶血产物样品；(d)将所述溶血产物样品与胰蛋白酶一起温育；(e)通过液相色谱法对经胰蛋白酶处理的样品中的HBB和HBS肽与其它组分进行色谱分离；(f)通过质谱法分析经色谱分离的HBB和HBS肽；以及(g)确定所述溶血产物样品中的HBB/HBS比率，其中约30％或更高的HBB/HBS比率指示所述保存的造血干细胞亚群在减轻所述受试者的镰状细胞疾病的一种或多种症状方面将是有效的。

还提供了试剂盒，其包含a)包含纯化的HBB肽的组合物，其中所述肽包含SEQ IDNO:1并且其中所述组合物不包含全长血红蛋白β(HBB)多肽序列；和b)包含纯化的HBS肽的组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:2，其中所述组合物不包含全长镰状血红蛋白β(HBS)多肽序列，并且其中所述HBB肽和所述HBS肽中的一个或多个包含标记物。

附图说明

图1是由与HBB和HBS的前十三个氨基酸残基相对应的合成多肽的固定比率稀释液获得的HBB/(HBB+HBS)标准曲线。

图2是利用HBB/HBS定量的基因矫正程序的时间表。

图3提供SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1的胰蛋白酶产物的飞行时间(TOF)-MS质量(461.77(峰值，标记7390)和476.76)的洗脱图。

发明详述