[发明专利]以RNA通过干细胞分化诱导胰脏β细胞

说明书

本发明涉及一种以前所未有的效率和功能由人类诱导的多能干细胞诱导或产生胰脏β细胞的新颖方法。本发明的核心在于在多个关键分化决定点使用实验上发现的mRNA以先前未知的方式沿多能至中内胚层至内胚层至胰脏内分泌细胞至胰脏β细胞的路径来实现。

相关申请的交叉参考

本申请要求2016年11月16日提交的美国临时专利申请第62/423,120号的权益，所述申请以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及利用细胞密度、试剂浓度和mRNA的特定组合的特定组合和范围通过动力学控制的细胞生长方法引导胰脏β细胞自多能干细胞的诱导。

背景技术

在人类干细胞的产生和随之而来的分化方面的最近成果已改变关于细胞命运的可塑性、人类疾病模型和临床疗法的范例。由体细胞制得的胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)二者可分化成一系列日益增加的不可与其对应初生细胞区分的特定细胞类型。因此，干细胞对于研发新的人类细胞疗法来说非常有前景。iPSC在个体化用药领域中展示特定潜力，归因于细胞的无限可用性、获得细胞的程序的非侵袭性和对个别患者免疫匹配各治疗的可能性，从而给予免疫抑制药物自由。

大批研究经费花费在研发治疗或预防各种人类疾病的细胞置换疗法上。举例来说，自体免疫造成患有1型糖尿病(T1D)的患者损失其胰脏β细胞-且因此损失其响应血糖含量和产生其自身胰岛素的能力。因此，T1D患者可极大受益于用外部源对其产生胰岛素的β细胞的置换。已成功进行一些含有产生胰岛素的β细胞以及其它内分泌细胞的人胰岛的移植，但发现供体胰腺的可靠供应源仍然是待克服的巨大障碍。现在，许多学术和工业群体已研发引导ESC或iPSC变为胰脏祖细胞的方式，旨在产生胰岛素分泌β细胞，希望最终将干细胞疗法用于衍生的产生胰岛素的葡萄糖响应细胞。然而，到此申请的时间，大多数公有领域中已知的这些方法可能不会完全产生功能性或成熟的胰岛素分泌胰脏β细胞。

为缓解成本负担和不一致性，所属领域的技术人员常常诉诸于发现可影响信号路径的小分子作为生长因子受体的激动剂或拮抗剂，从而以取代生长因子的方式。小分子通常远比生长因子便宜。然而，小分子的主要不足的处在于非特异性影响，其可作用于非预期标靶，如细胞膜结合受体、胞内细胞器、或基因组组分等。

典型分化方案的另一关键组分是培养细胞的介质，所述介质可由营养素(脂质、氨基酸、碳水化合物、维生素等)、适当浓度的盐、pH缓冲剂、关键元素和如胰岛素或血清白蛋白的常见蛋白因子组成。不同类型的细胞具有不同的营养素和介质组分需求且由用于信号传递的细胞类型特异性生长因子和小分子进一步复杂化。因此，专用“分化培养基”常常通过每次去除或添加一种组分来费力地测试。

在干细胞衍生的组织细胞的临床应用中，所建立的分化介质的大多数组分需要在当前良好作业规范(cGMP)规章下的个体认证；例如，需要通过专用程序制造生长因子且需要个体认证。同样地，添加至特定分化介质中的一些小分子通过在纯度、稳定性和毒性方面变化的专用化学合成方法制造。在干细胞培养物的领域中，一些先前出版的方案还依赖于动物产物，如血清或基质胶。

发明内容

尽管最近在产生iPSC衍生的胰脏β细胞方面取得进展，但始终产生产生胰岛素的β细胞的有效方法仍在研发。许多当前方案在沿着分化级联的各步骤中需要使用生长因子、激素、细胞因子、信号肽和其它细胞间信号分子(在本文中为简单起见总称为生长因子)以产生产生胰岛素的β细胞。不幸地，当作为纯化多肽供应时，生长因子通常为昂贵的、不稳定的且批次间不兼容，使得其难以使用。另外，因为生长因子以高度特定却又组合的方式起作用，所以分化的各阶段由不同组生长因子指示，此优化困难且昂贵。本发明的一个目标为在导引胰脏β细胞的产生中根本上去除对生长因子的需要。

本发明提供通过调节细胞生长动力学和相关参数诱导干细胞分化的方法，其中细胞密度、试剂浓度和mRNA的组合的特定组合用于控制分化/诱导方向。