[发明专利]使用亚磷酰胺化学法合成主链修饰的吗啉代寡核苷酸和嵌合体

说明书

提供了与经典N，N‑二甲基氨基PMO类似物不同的胺取代的吗啉代寡核苷酸、以及以高产率有效合成这些寡核苷酸的方法。具有硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基磷酸二酯、和烷基氨基磷酸酯连接基的吗啉代寡核苷酸。可制备含有未修饰的DNA/RNA以及其他DNA/RNA类似物的嵌合体。这些寡核苷酸与互补DNA或RNA形成双链体，该双链体比天然DNA或DNA/RNA复合物更稳定，对核糖核酸酶H1具有活性，并且可以使用标准脂质试剂被转染到细胞中。因此，这些类似物可用于许多应用。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年5月31日提交的美国临时专利申请序列号62/513,089和2016年9月20日提交的美国临时专利申请序列号62/397,277的权益，将这两个申请通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本公开文本涉及合成吗啉代寡核苷酸及其衍生物的方法。

背景技术

由于吗啉代寡核苷酸对DNA和RNA的高亲和力、对各种核酸酶的抗性、体内稳定性、和低毒性，它们显示出用作反义寡核苷酸治疗剂的前景。二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸(PMO；化合物3，图1)具有非离子核苷酸间键和替代DNA脱氧核糖的吗啉基。这些N,N-二甲基氨基二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸通过在干扰RNA剪接的同时阻止翻译来抑制基因表达(Summerton,J.Biochim.Biophys.Acta1999,1489,141-158)，对细胞核酸酶具有抗性(Hudziak,等人Antisense Nucleic Acid Drug Dev.1996,6,267-272；Arora,等人J.Pharm.Sci.2002,91,1009-18.)，并且具有比DNA更高的RNA结合亲和力(Summerton,J.E.Morpholinos and Related Antisense Biomolecules(Janson,C.G.和During,M.J.编辑),2003,Kluwer/Plenum Publishers.)。正在进行PMO的治疗开发，例如用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)的临床试验，以及预防出血性丝状病毒属马尔堡病毒的感染(美国专利公开物2016/0040162和2015/0038462)。另外，已经研究了PMO在纳米技术(Paul,等人,Chem.Commun.,2013,49,11278-80)和表面杂交(Tercero,等人,J.Am.Chem.Soc.,2009,131:4953)中的应用。

不幸的是，由于缺乏有效的合成方法学，PMO的这些有前景的应用受到严重限制。与用于在自动化合成仪上化学制备DNA和RNA的标准方法相反，PMO目前在聚苯乙烯树脂上以5’至3’方向合成。作为第一步骤，5’-羟基-N-三苯甲基-吗啉代核苷与N,N-二甲基氨基二氯氨基磷酸酯缩合生成N,N-二甲基氨基氯氨基磷酸酯合成子。在碱存在下的偶联产生与树脂附接的二聚体。进一步用酸进行脱三苯甲基化生成二聚体，该二聚体可通过重复该循环而延长。这种方法存在若干公认的问题。例如，缩合产率低(二胸苷吗啉基的回收产率为45％)并且需要长的反应时间。此外，5’-氯-氨基磷酸酯单体是不稳定的，并且在大量碱存在下偶联两个吗啉基单体是困难的(Bhadra,等人,Tetrahedron Letters 2015,56:4565-68)。另外，这种方法需要特殊的程序、技术和材料(例如可溶胀的聚苯乙烯树脂、独特的反应容器、和作为脱三苯甲基化剂的三氟乙酸吡啶鎓盐)，这些程序、技术和材料在大多数实验室中不易获得。

最近，已使用H-膦酸酯化学法开发了一种用于合成聚胸苷PMO的新方法。这种方法也存在问题。例如，因为H-膦酸酯中的磷原子是亲电子的并且缺少孤对电子，所以它在环境条件下的抗氧化性比大多数P(III)化合物大得多。此外，形成H-膦酸酯吗啉代二聚体的偶联产率低(77％)。

通过本公开文本的方法克服了前述缺点中的每一个。另外，本公开文本的方法实现了下面更全面讨论的其他优点。

发明内容