[发明专利]使用亚磷酰胺化学法合成主链修饰的吗啉代寡核苷酸和嵌合体

权利要求书

1.一种制备亚磷酰二胺单体的方法，包括：

a使5’-O-二甲氧基三苯甲基核糖-碱基与高碘酸钠和硼酸氢铵接触以产生二羟基核糖吗啉基单体，其中该碱基是胸苷、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤中之一，任选地在核苷氨基上被保护基团保护，

b用氰基硼氢化钠将该二羟基核糖吗啉基单体上的羟基还原以生成吗啉基单体，

c用2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺和4,5-二氰基咪唑(DCI)将该吗啉基单体在二氯甲烷中亚磷酰胺化以产生亚磷酰二胺单体，

其中，所述亚磷酰二胺单体具有式I的化学结构：

其中：

B为

B*是

X是氰基乙基；

R是二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；和

R₁和R₂是异丙基。

2.一种形成包含至少一种单体亚基的寡聚物的方法，包括：

a提供与聚苯乙烯/CPG载体连接的5’-未保护的-2’-脱氧核糖核苷；

b使该5’-未保护的-2’-脱氧核糖核苷与权利要求1中的亚磷酰二胺单体在含有4,5-二氰基咪唑(DCI)的无水乙腈中反应以生成具有亚磷酰胺二酯核苷酸间键的二聚体；

c将该二聚体化学活化，包括将该二聚体硼化、或氧化中的至少一种，d将该二聚体加帽，

e将该二聚体脱三苯甲基，

f重复步骤b至e以将该寡聚物延长，

g使吗啉代硼烷氨基磷酸酯单体与碘和二甲基胺在四氢呋喃中接触以将吗啉代氨基磷酸酯转化为N,N-二甲基氨基PMO，

h使该寡聚物与包含氢氧化铵和乙二胺的溶液接触以将该寡聚物从该聚苯乙烯载体上除去，

其中，所述包含至少一种单体亚基的寡聚物具有式II的化学结构：

其中：

式II中的每个B独立地是

式II中的X是二甲基氨基；

式II中的Y是氧，并且

式II中的每个R独立地连接于玻璃基底、聚苯乙烯树脂、DNA或RNA寡核苷/寡核苷酸、或式II的另一个吗啉基，其中该连接基是具有磷酸酯键的二氨基磷酸酯连接基、或氨基磷酸酯连接基、磷酸酯键、或硫键。

3.权利要求2的方法，其中，所述寡聚物具有2-40个单体亚基。

4.权利要求2或3的方法，其中，该活化步骤c.包括将该二聚体硼化并且进一步包括以下附加步骤：在该延长步骤f之后并且在该接触步骤g之前将氰基乙基从该核苷酸间键上除去。

5.权利要求2-4中任一项的方法，其中，该活化步骤c.包括将该二聚体硼化并且进一步包括以下附加步骤：在该接触步骤g之后并且步骤h之前，使该单体与四丁基氟化铵(TBAF)在THF中的溶液接触以将BIBS保护基团从该单体上除去。

6.权利要求2-5中任一项的方法，其中，该重复合成步骤f.在商业DNA合成仪上进行。