[发明专利]基因型分型测定中的非独特条形码

说明书

本公开涉及ctDNA测定，其以高精确性和准确性从单个样本中查询多个区域，同时评估包括序列突变和结构改变的多种形式的癌症相关的基因组改变。本公开提供了通过使用有限的非独特条形码池与内源条形码组合分析癌症基因来实现高灵敏性和特异性的简化但稳健的方法。使用高覆盖率下一代测序捕获并测序样本，以允许识别肿瘤特异性体细胞突变、扩增和易位。

相关申请(一个或多个)的交叉引用

本申请要求2016年11月15日提交的美国临时申请序号62/422,355的权益和优先权，其内容以其整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及用于分析肿瘤特异性生物标志的核酸的条形码化(barcoding)策略。

背景技术

仅在美国，癌症每年导致多于五十万人死亡。目前治疗的成功取决于癌症的类型及其被检测到时的分期。多种治疗包括昂贵且痛苦的手术和化学疗法，并且通常是不成功的。

突变的早期且准确检测对于有效的癌症治疗是必要的。个人化癌症治疗中的一个有前景的领域是分析循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA从肿瘤组织释放到血液中，携带肿瘤特异性基因改变，并且可以通过非侵入性液体活组织检查方法进行分析，以识别癌症患者中的基因改变。液体活组织检查提供了相当大的优势，因为它们可以消除对侵入性程序的需要，允许治疗反应的早期测量，并且允许在治疗过程中检测多个转移性病灶的改变。

然而，由于当前基因型分型技术的限制，查询(interrogate)血液中的ctDNA一直有问题。从血液样本中获得的ctDNA的分数通常非常低(<1.0％)并且可能难以检测。大多评估ctDNA的方法查询单个热点突变或仅一些基因改变。在无细胞DNA(游离DNA，cell-freeDNA)中的常规基因型分型具有约1％的错误率，这使得难以或不可能使用常规分子条形码化技术识别样本中具有<1％流行率(普遍性，prevalence)的突变。目前的方法不提供足够的分析灵敏性和特异性。

发明内容

本公开涉及ctDNA测定，其以高精确性和准确性从单个样本查询多个基因组区域，同时评估包括序列突变和结构改变的多种形式的癌症相关基因组改变。本公开提供了通过利用有限的非独特条形码池与内源条形码组合分析癌症基因来实现高灵敏性和特异性的简化但稳健的方法。使用高覆盖率下一代测序(high coverage next-generationsequencing)来捕获并测序，以允许识别肿瘤特异性体细胞突变和易位。针对序列突变或重排的分析可以一起或单独进行——取决于目标的具体改变。所公开的方法针对诊断、法医、系谱和临床目的提供了增加的测序灵敏性和特异性。

所公开的方法尤其适于适应(accommodating)低丰度样本DNA，如在液体活组织检查中。液体活组织检查评估血液中DNA的循环肿瘤DNA。循环肿瘤DNA(ctDNA)可以通过肿瘤细胞的凋亡进入血流，并且当被检测到时，允许诊断、基因型分型和疾病监测，而无需传统的侵入性活组织检查程序。然而，ctDNA水平总体上非常低，尤其是对于早期肿瘤，这使得其难以依赖ctDNA进行检测和分析。本发明用识别含有限量DNA模板的样本中的稀有突变的方法解决了此问题。本发明的方法降低了大规模平行测序仪器中固有的错误率的影响(effect)。没有本公开的方法，那些仪器中固有的错误率通常太高而不能识别多数样本中的稀有突变。

方法可包括从血浆样本中提取和分离无细胞DNA，并将外源条形码分配至每个片段以产生DNA文库。外源条形码来自有限的非独特条形码池，例如8种不同的条形码。条形码化的片段基于它们的外源条形码和由每个无细胞DNA分子的片段末端的基因组位置产生的内源条形码的组合而被分化。DNA文库被冗余测序，并协调(调整，reconcile)具有匹配条形码的序列。将协调的序列与人类基因组参考比对，并将比对序列中存在的变体识别为真实突变。