[发明专利]用于多重检测甲基化DNA的方法

说明书

本发明涉及一种用于多重检测靶标DNA的甲基化的方法和一种用于检测靶标DNA的甲基化的组合物，并且更具体地，涉及一种用于通过如下方式检测靶标DNA的甲基化的方法：构建包含能够与该靶标DNA互补结合的靶标特异性序列和不能够与该靶标DNA互补结合的通用引物的寡核苷酸，用该寡核苷酸充当引物对该靶标DNA进行线性扩增，并通过能够与该线性扩增的DNA互补结合的该寡核苷酸、该通用引物和探针对该线性扩增的靶标DNA进行扩增。

技术领域

本公开文本涉及一种用于多重检测靶标DNA的甲基化的方法和一种用于检测靶标DNA的甲基化的组合物，并且更具体地，涉及一种用于检测靶标DNA的甲基化的方法，其包括：构建寡核苷酸，其包含能够与靶标DNA互补结合的靶标特异性序列和与靶标DNA不互补的人工引物；通过使用该寡核苷酸作为初级引物对靶标DNA进行线性扩增用于线性靶标富集(下文称为LTE)；使用来自用作初级引物的寡核苷酸(其能够与该线性扩增的靶标DNA互补结合)的分离物和与该线性扩增的靶标DNA不互补的通用引物对该线性扩增的靶标DNA进行扩增；并且通过探针检测是否存在扩增产物。

背景技术

在哺乳动物细胞的基因组DNA中，除了A、C、G和T外还有第五个碱基，即5-甲基胞嘧啶，其中一个甲基基团与胞嘧啶环的第五个碳附接(5-mC)。5-mC总是仅与CG二核苷酸(5’-mCG-3’)的C附接，该CG二核苷酸通常被标记为CpG。CpG的C大多通过与甲基附接而甲基化。该CpG的甲基化抑制了基因组中的重复序列(如Alu或转座子)的表达。此外，该CpG是哺乳动物细胞中最常出现表观遗传变化的位点。该CpG的5-mC天然脱氨至T，并且因此，哺乳动物基因组中的CpG显示的频率仅为1％，远低于正常频率(1/4x1/4＝6.25％)。

CpG异常整合的区域称为CpG岛。术语“CpG岛”是指长度为0.2-3kb并且C+G含量大于50％并且CpG比例大于3.75％的位点。人类基因组中有约45,000个CpG岛，并且主要在调节基因表达的启动子区域中发现它们。实际上，CpG岛出现在占人类基因约50％的管家基因的启动子中。已知异常DNA甲基化主要发生在基因的5’调节区，以减少基因的表达。

在本文中，基因的5’调节区包括启动子区、增强子区和＝5’非翻译区。最近，有人积极地进行了检查血液、痰、唾液、粪便或尿液中肿瘤相关基因的启动子甲基化并将检查结果用于各种癌症的诊断和治疗的尝试。

众所周知，DNA通过包括细胞凋亡和坏死的过程从癌症患者的癌组织中的异常细胞释放到血液中，并且因此在血液的血清或血浆中以无细胞肿瘤DNA的形式存在，并且甲基化的DNA片段也存在于无细胞肿瘤DNA中。这种异常DNA甲基化的存在已被用作诊断癌症的一种标志物。

同时，一般来说，用于分析基因甲基化的方法是通过检测不参与甲基化的对照基因、通过PCR以证实PCR的适合性和输入DNA的存在与否、以及与其平行进行PCR以检测靶标DNA的甲基化。

具体而言，作为通过实时PCR来分析甲基化的方法，可以考虑以下方法：i)使用靶标DNA甲基化非依赖性引物作为实时PCR的引物并使用能够与甲基化靶标DNA杂交的甲基化特异性检测引物以检测PCR扩增产物的方法；ii)使用靶标DNA甲基化特异性引物作为实时PCR引物并使用能够与PCR扩增产物中含有的甲基化非依赖性序列杂交的检测探针的方法；并且iii)使用靶标DNA甲基化特异性引物作为实时PCR引物并使用能够与甲基化靶标DNA杂交的甲基化特异性检测探针以检测PCR扩增产物的方法。

然而，这些方法都直接使用未富集的DNA作为模板，并且必须同时使用两种引物(正向和反向)来扩增靶标DNA。因此，每当待在一个试管(单个反应器)中扩增的靶标增加时，存在进一步需要两种引物的问题。