[发明专利]用于多重检测甲基化DNA的方法

权利要求书

1.组合物在制备用于检测甲基化DNA的试剂盒中的用途，所述组合物包括：

至少一种处理含靶标DNA的样品的试剂，该试剂修饰非甲基化DNA位点以使其区分于甲基化DNA位点；

反向引物，其包含能够与用该试剂处理的靶标DNA序列互补结合的靶特异性序列和不与该靶标DNA互补结合的通用引物，该通用引物融合至所述靶特异性序列的5’端，该试剂修饰非甲基化DNA位点以使其区分于甲基化DNA位点；

正向引物，其能够与线性扩增的靶标DNA互补结合，和通用引物，其不与该线性扩增的靶标DNA互补结合；和

探针，其能够与该线性扩增的靶标DNA序列互补杂交，

其中该甲基化DNA是通过以下进行检测的：

(a) 用至少一种修饰非甲基化DNA位点以使其区分于甲基化DNA位点的试剂处理含靶标DNA的样品；

(b) 构建反向引物，其包含被设计为能够与用该试剂处理的靶标DNA互补结合的靶标特异性序列和不与该靶标DNA互补结合的通用引物，该通用引物与该靶特异性序列的5’端结合；

(c) 使用步骤 (a) 中用该试剂处理的靶标DNA作为模板，并使用步骤(b) 中构建的该反向引物作为引物，通过单向PCR进行单向非对称线性扩增；

(d) 使用一种能够与步骤 (c) 中线性扩增的DNA互补结合的正向引物和一种通用引物来扩增该靶标DNA；并且

(e) 通过能够与步骤 (d) 中扩增的靶标DNA序列互补杂交的探针检测该靶标DNA的甲基化。

2.权利要求1的用途，其中该试剂为重亚硫酸盐。

3.权利要求1的用途，其中通过用该试剂处理，将至少一个胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或与胞嘧啶不同的另一种碱基。

4.权利要求1的用途，其中检测单个反应器中样品中的多个靶标DNA甲基化。

5.权利要求1的用途，其中该步骤 (b) 或 (d) 的该通用引物包含选自由SEQ ID NO:7和35至41表示的核苷酸序列的一个或多个序列。

6.权利要求1的用途，其中步骤 (b) 的该靶标特异性序列与该靶标DNA的甲基化位点和/或非甲基化位点互补结合。

7.权利要求1的用途，其中步骤 (b) 的该靶标特异性序列包含一个或多个CpG二核苷酸。

8.权利要求1的用途，其中步骤 (b) 的该靶标特异性序列包含选自由SEQ ID NO: 2、5、9、14、17、21和26表示的序列的一个或多个序列。

9.权利要求1的用途，其中甲基化的检测是通过选自以下的任一种方法进行：PCR、DNA芯片分析和测序。

10.权利要求9的用途，其中甲基化的检测是通过甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR、合成测序或连接测序进行的。

11.权利要求10的用途，其中甲基化的检测是通过实时甲基化特异性PCR或使用甲基化DNA特异性结合抗体的PCR进行的。

12.权利要求1的用途，其中步骤 (d) 的该正向引物包含一个或多个CpG二核苷酸。

13.权利要求1的用途，其中步骤 (d) 的该正向引物包含选自由SEQ ID NO: 1、4、8、10至13、15、16、18至20、22至25、27和28表示的序列的一个或多个序列。

14.权利要求1的用途，其中步骤 (e) 的该探针包含一个或多个CpG二核苷酸。

15.权利要求1的用途，其中步骤 (e) 的该探针包含选自由SEQ ID NO: 3、6、29、30和31至34表示的序列的一个或多个序列。