[发明专利]可转化的衔接子

说明书

本发明涉及一种方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包含单链或至少部分双链的衔接子，所述衔接子包含具有碱基修饰的序列，所述碱基修饰与核酸片段连接并转化以生成用于特异性识别的非对称末端。该方法基于两种主要的序列转换机制，即特定碱基的直接转化和通过复制的间接转化，其中这两种机制可以组合在一起。

本发明属于生物化学和诊断领域。它尤其属于分子生物学和核酸库的生成领域，更具体地涉及到用于测序的核酸库模板的生成。

背景技术

基础研究、诊断、治疗和取证中的许多方法都基于核酸分析。最近，已经开发出高度平行的过程，例如微阵列和下一代测序(也称为“大规模平行测序”)，其允许同时分析数千、数百万甚至超过数十亿的不同核酸分子。为此，需要将核酸转化为一个通用形式，以作为核酸库而被并行处理。最佳的库形式是为未知核酸提供的常见侧翼序列，即所谓的衔接子。由于许多分析过程需要诸如PCR之类的核酸扩增步骤，因此侧翼序列代表至少两种不同特异性引物的结合位点。向未知核酸中添加衔接子的经典方法是首先生成平端的双链DNA片段。然后将这些片段与两种不同的平端双链衔接子一起培养，并用连接酶(例如T4DNA连接酶)连接。为了避免过量的衔接子二聚体，只有平端的双链DNA片段被磷酸化，并且衔接子只有一端可以连接。然而，使用平端DNA得到的连接效率低于使用粘性末端。此外，由于片段排列被连接到两个不同的衔接子，所以只有一半的连接产物在两端产生不同的衔接子。因此，在PCR中只能有效地扩增一半的连接产物。较新的方法涉及到使用具有两个不同引物结合位点的一个衔接子，所述引物结合位点连接至给定双链DNA片段的每个末端的5’和3’末端。因此，双链DNA片段的两条链中的每一条都具有不同的引物结合位点，以实现高效的PCR扩增。通过向双链DNA片段添加确定的3’单碱基突出端，并利用具有互补单碱基突出端的衔接子，使连接反应更加有效并且不产生任何二聚体或其他多聚体。目前，两种商业方法解决了这些与经典衔接子相关的问题。WO 2007/052006 A1中公开的一种方法基于Y形衔接子形式，该形式代表两个退火的寡核苷酸，该寡核苷酸包含可连接末端的互补双链区和未配对核苷酸(包含可用作特异性引物结合位点的不同序列)的叉状端或尾端。WO 2009/133466A2中公开的另一种方法基于一种发夹形衔接子，其包含一个部分退火的寡核苷酸，该寡核苷酸含有在可连接的5’和3’末端的互补双链区域和环状连接部分，所述连接部分包含可用作特定引物结合位点的不同序列。该环包含易切割部分，其在连接后必须在另外的处理步骤中裂解，以便与下游核酸库处理步骤(例如PCR)匹配。发夹和Y衔接子形式产生位于核酸库插入物两端侧翼的共同序列，其在测序中需要更长的引物，以使测序反应仅对一个末端特异。WO 2009/133466 A2中公开的另一种非商业衔接子形式基于一种衔接子，该衔接子在第一引物延伸步骤后在引物结合位点下游产生不同的限制酶裂解位点。这允许在裂解后与包含不同引物结合位点的第二衔接子连接。然而，这些方法包括额外且繁琐的处理步骤，或需要长的衔接子寡核苷酸，与简单的双链衔接子相比，这些长的衔接子寡核苷酸在化学合成和连接方面效率较低。需要提供一种方法，其在PCR之前连接后不需要复杂的酶处理步骤，并且使用较短的双链衔接分子，同时没有那些不在生成的核酸库中产生共同侧翼序列的复杂结构。

发明内容

本发明解决了有关提供一种基于单个衔接分子的方法的技术问题，所述单个衔接分子无包含分叉或发夹结构的长条形寡核苷酸，被起连接作用的酶很好地接受，并且在连接后无需额外的步骤来生成在末端没有广泛的共同序列的核酸库。

该技术问题的一解决方式是提供至少部分双链的衔接子，其序列在连接后转化，所述衔接子在引物结合位点区域包含一个或多个修饰碱基；所述引物结合位点连接至核酸片段的两端，并转化为至少两个不同的引物结合位点，用于与一种以上的特异性引物发生有效的扩增反应。