[发明专利]可转化的衔接子

权利要求书

1.一种用于产生非对称标记核酸片段的方法，所述方法包括以下步骤：

i.将第一衔接子核酸分子连接至双链核酸片段的模板链以及将第二衔接子核酸分子连接至所述双链核酸片段的互补链；其中所述第一和所述第二衔接子核酸分子酸的特征在于具有相同的碱基序列，并且包含连接位点和引物结合区，并且所述引物结合区包含至少一个通用碱基和/或至少一个可转化碱基，并且其中可选地所述第一衔接子核酸分子和所述第二衔接子核酸分子至少部分是双链的，并且其中可选地两条链都是所述第一和所述第二衔接子核酸分子，并且与所述双链核酸片段连接；

ii.可选地将包含所述第一和/或所述第二衔接子核酸分子的所述至少一个可转化碱基转化为至少一种转化碱基；

iii.通过进行第一延伸步骤获得第一反义衔接子核酸分子和第二反义衔接子核酸分子，其中：

-延伸所述互补链，从而产生与所述互补链连接的所述第一反义衔接子核酸分子，并延伸所述模板链，从而产生与所述模板链连接的第二反义衔接子核酸分子；或者

-将引物退火至与所述模板链连接的所述至少部分双链的第二衔接子核酸分子的链并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述模板链互补的核酸序列、以及所述第一反义衔接子核酸分子；以及

将引物退火至与所述互补链连接的所述至少部分双链的第一衔接子核酸分子的链并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述互补链互补的核酸序列、以及所述第二反义衔接子核酸分子；

其中所述第一反义衔接子核酸分子与所述第一衔接子核酸分子基本上互补，所述第二反义衔接子核酸分子与所述第二衔接子核酸基本上互补，但在与所述第一和第二衔接子核酸分子内包含的所述至少一个通用的、可转化的或已转化的碱基相对的位置除外，从而产生非对称标记核酸片段。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个可转化碱基和所述至少一种转化碱基优选与不同碱基配对。

3.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：

-所述第一延伸步骤，其中延伸所述互补链，从而产生与所述互补链连接的所述第一反义衔接子核酸分子，并延伸所述模板链，从而产生与所述模板链连接的所述第二反义衔接子核酸分子；以及

-第二延伸步骤，其中

·将引物退火至所述第二反义核酸分子并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述互补链互补的核酸、以及第三反义衔接子核酸分子；

·将引物退火至所述第一反义衔接子核酸分子并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述模板链互补的核酸、以及第四反义衔接子核酸分子；以及

·所述第三反义衔接子核酸分子与所述第一衔接子核酸分子基本上互补，所述第二反义衔接子核酸分子与所述第二衔接子核酸基本上互补，但在与所述第一和第二衔接子核酸分子内包含的所述至少一个通用的、可转化的或已转化的碱基相对的位置除外，并且所述第三和第四反义衔接子核酸分子的特征在于具有不同的碱基序列，从而产生非对称标记核酸片段。

4.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：

-所述第一延伸步骤，其中

·将引物退火至与所述模板链连接的所述至少部分双链的第二衔接子核酸分子的所述链并延伸，从而产生包含所述引物的所述核酸链、与所述互补链互补的所述核酸、以及所述第一反义衔接子核酸分子；以及

·将引物退火至与所述互补链连接的所述至少部分双链的第一衔接子核酸分子的所述链并延伸，从而产生包含所述引物的所述核酸链、与所述模板链互补的所述核酸、以及所述第二反义衔接子核酸分子；以及

-第二延伸步骤，其中

·将引物退火至所述第二反义核酸分子并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述互补链互补的核酸、以及第三反义衔接子核酸分子；以及

·将引物退火至所述第一反义衔接子核酸分子并延伸，从而产生包含所述引物的核酸链、与所述模板链互补的核酸、以及第四反义衔接子核酸分子；以及

·所述第三反义衔接子核酸分子与所述第一衔接子核酸分子基本上互补，所述第四反义衔接子核酸分子与所述第二衔接子核酸基本上互补，但在与所述第一和第二衔接子核酸分子内包含的所述通用的、可转化的或已转化的碱基相对的位置除外，并且所述第三和第四反义衔接子核酸分子的特征在于具有不同的碱基序列，从而产生非对称标记核酸片段。