[发明专利]分化多能细胞的方法

说明书

在一些方面中，提供了用于使用单‑SMAD抑制或仅用一种SMAD抑制剂抑制SMAD信号转导将多能细胞分化成中脑多巴胺能(DA)神经元的方法。在一些实施方式中，单‑SMAD抑制利用骨形态发生蛋白(BMP)的单一抑制剂将多能细胞分化成中脑DA神经元。

背景技术

本申请要求2016年08月16日提交的美国临时专利申请62/375,590的权益，其全部内容通过引用纳入本文。

1.发明领域

本发明一般涉及分子生物学和医学领域。更具体地，其涉及由多能细胞生成多巴胺能神经元的方法。

2.背景技术

保留分化成多种具体细胞类型能力的细胞群能够用于产生大量谱系特异性分化的细胞群。考虑将这些谱系特异性分化的细胞群用于针对患有导致限定细胞群功能丧失的疾病的患者的细胞替代疗法。除了其直接的治疗性价值，谱系特异性分化的细胞还是用于各种目的的有价值研究工具，包括体外筛选试验以鉴定、确认和测试具体功能或用于测试递送治疗性分子以治疗细胞谱系特异性疾病。

例如，在帕金森病的情况中，中脑多巴胺能(DA)神经元的损失导致出现疾病症状。因此，需要由多能细胞产生DA神经元细胞的方法，因为这类细胞可以治疗性地使用并用于疾病模型，例如，以鉴定用于帕金森病治疗的新型治疗。

已经尝试了各种方法由多能细胞生成中脑DA神经元。例如，由多能细胞生成中脑DA神经元的方法通常需要使用DN-193189，其是BMP信号转导的抑制剂(抑制ALK 1/2/3/6，阻断SMAD 1/5/8)和SB-431542，其是TGF-β信号转导的抑制剂(抑制ALK 4/5/7，阻断SMAD2/3)，如在WO2013/067362中所述。因为这些方法利用小母抗Dpp(Small Mothers AgainstDecapetaplegic，SMAD)信号转导的2个抑制剂的组合，所述这些方法通常被称为“双SMAD抑制”或“双SMADi”。虽然可能需要发明仅使用单一SMAD抑制剂由诱导型多能干(iPS)细胞生成中脑多巴胺能(mDA)神经元的方法，但是迄今为止这些努力都是失败的。显然，存在对使用单一SMAD抑制剂由iPS细胞生成mDA神经元的方法的需求。

发明内容

在一些方面中，本发明通过提供这样的方法克服了现有技术的限制，所述方法使用单-SMAD抑制(单-SMADi)由多能细胞生成神经元。单-SMADi方法的使用可以提供相对于需要使用2个或多个SMAD抑制剂的SMAD信号转导抑制的方法的优势。如下述实施例中所述，提供了由多能细胞，如人诱导的多能细胞(iPS细胞)生成神经细胞系，如多巴胺能神经元。如所示，这些方法可以包括数个方面，其包括：(i)交错安排(stagger)Wnt激动剂(例如，

CHIR99021)的添加至第2天或第3天，(ii)将CHIR浓度再优化(例如，使用约0.5-3.0μM，0.7-3μM，1-2.5μM，1.25-2.25μM，大于约1.25μM至约2μM，或约1.55，1.65，1.75μM，或从中衍生的任何范围)，和/或(iii)在第3-5天将MEK抑制剂(例如，PD0325901)包含在分化培养基中。该方法可以包括例如，上述方面(i和ii)、(ii和iii)，(i和iii)或(i，ii和iii)。在一些实施方式中，将细胞暴露于BMP抑制剂(例如，背吗啡(dorsomorphin)或LDN-193189)，而将细胞不暴露于TGF-β抑制剂如SB431542，以促进细胞分化成中脑DA神经元或FOXA2⁺/LMX1A⁺细胞。如小鼠实施例所示，这些方法可以用于以仅含单一SMAD抑制剂(例如，仅有背吗啡或仅有LDN-193189)的培养基由iPS细胞系的高效mDA祖细胞形成。