[发明专利]细胞VAMP切割测定

说明书

本发明涉及适于产生针对VAMP C‑末端神经毒素切割产物的抗体的VAMP表位，它们用于产生针对切割的VAMP的抗体的用途以及基于信号增益这些抗体在细胞VAMP切割测定中的用途。

发明领域

本发明涉及用于VAMP切割梭菌神经毒素的基于细胞的测定。

背景

梭菌属中的细菌产生高效且特异性的蛋白质毒素，这些毒素可以毒害它们所传递到的神经元和其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(C.tetani，破伤风神经毒素)和肉毒杆菌(C.botulinum，肉毒杆菌神经毒素血清型A至G)产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。

梭菌神经毒素通过抑制周围神经系统中，特别是在神经肌肉接头处的胆碱能传递起作用。在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其通过蛋白水解切割事件在翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，通常被称为活化位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)(具有约100kDa的分子量)和轻链(L链)(具有约50kDa的分子量)。H链包含N末端易位组分(H_N结构域)和C末端靶向组分(H_C结构域)。切割位点位于L链和H_N结构域之间。在H_C结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化到细胞中之后，H_N结构域将L链转移穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割被称为SNARE蛋白(例如SNAP25，VAMP或syntaxin)的细胞内转运蛋白起作用-参见GeraldK(2002)“Cell and Molecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons，Inc。缩写SNARE来自术语可溶性NSF附着受体，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感因子。首字母缩写SNAP25来自术语25千道尔顿的突触体相关蛋白。首字母缩写VAMP来自术语囊泡相关膜蛋白。SNARE蛋白是细胞内囊泡融合组成部分，从而是通过囊泡运输而从细胞分泌分子的组成部分。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，对SNARE蛋白显示出高底物特异性。因此，一旦递送到所需的靶细胞，非-细胞毒性蛋白酶能够抑制细胞从靶细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性的蛋白酶。BoNT/B，BoNT/D，BoNT/F，BoNT/G，BoNT/X和TeNT的L链蛋白酶切割VAMP(也称为synaptobrevins)，BoNT/A和BoNT/E的L链蛋白酶切割SNAP25并且BoNT/C的L链蛋白酶切割SNAP25和突触融合蛋白，这导致神经递质释放的抑制和随后的神经麻痹(Rossetto，O.等人，“Botulinumneurotoxins：genetic，structural and mechanistic insight”.Nature ReviewsMicrobiology 12.8(2014)：535-549)(Zhang等人，“Identification andcharacterization of a novel botulinum neurotoxin”；Nature Communications，2017,8：14130)。

梭菌神经毒素通过其受体结合结构域(H_C)与其特异性受体结合而靶向并进入神经元，这些结构域在文献中有明确定义(Schiavo，G.，Matteoli，M.&Montecucco，C.Neurotoxins affected neuroxocytosis，Physiol Rev)，2000,80,717-766)。受体结合决定了BoNT识别神经元的功效和特异性。BoNT/B，D-C和G共有两个同源突触小泡蛋白突触结合蛋白I和II(Syt I/II)作为它们的受体，而BoNT/A，E，D，F和TeNT使用另一个突触小泡蛋白SV2。除蛋白质受体外，所有BoNT都需要脂质共受体神经节苷脂，其在神经元表面上是丰富的。