[发明专利]从核酸测序制备物除去衔接子二聚体的方法

说明书

提供了制备用于测序的多核苷酸的测序衔接子和方法。所述测序衔接子包含甲基依赖性内切核酸酶的识别序列的一部分。在衔接子与靶多核苷酸连接期间形成的不需要的衔接子二聚体产生完整的限制序列并被内切核酸酶切割，然后进行外切核酸酶消化，从而除去所述二聚体。

发明领域

本发明涉及用于从核酸测序样品制备混合物除去不需要的衔接子二聚体的方法和组合物。

背景

大多数DNA测序技术依赖于特异性DNA衔接子与样品DNA片段末端的连接，以创建聚合酶引物位点、添加样品捕获位点、将样品“条码化”，以及向样品添加校准位点，以及许多可能的用途。将衔接子核酸连接至待测序的DNA样品的每个末端。衔接子连接的DNA片段的创建通常包括相互连接的衔接子，形成不需要的“衔接子二聚体”。

目前，通过小片段清除步骤除去衔接子二聚体，例如使用磁珠捕获大的多核苷酸片段并与小片段分离。这种方法不是基于序列的，并且因此是非特异性和低效的。如果样品是环化的，则可以通过用外切核酸酶处理使非环化的衔接子从其暴露的末端解聚。特别地，从一组近似或相似大小的DNA样品片段中去除环化的衔接子二聚体是特别困难的。清除步骤没有基于尺寸有效地除去二聚体或花费相当长的时间。此外，环状衔接子不能被外切核酸酶解聚，因为它们没有暴露的末端。

需要更有效和特异的方法来除去不需要的衔接子二聚体。

发明内容

提供了用于多核苷酸测序的衔接子以及将其用于测序方法的方法和试剂盒。本文所述的衔接子和方法可用于产生用于测序的多核苷酸样品，其没有衔接子二聚体或具有极低水平的衔接子二聚体，否则所述衔接子二聚体会干扰多核苷酸测序方法或降低多核苷酸测序方法的效率。

一方面，提供了制备用于测序的靶DNA双链体的方法。在本文公开的方法中，衔接子包含甲基依赖性内切核酸酶识别序列的一部分，当其在衔接子二聚体中共价连接时，将形成完整的识别序列并将被内切核酸酶消化。通过甲基依赖性内切核酸酶消化，然后通过外切核酸酶消化，来除去衔接子二聚体。与用于测序的靶多核苷酸连接的衔接子对内切核酸酶和外切核酸酶的消化不敏感，并且因此仅从样品中除去不需要的衔接子二聚体。

在一个实施方案中，所述方法包括：(a)将多个测序衔接子的双链多核苷酸双链体区共价连接至多个平端靶DNA双链体的第一和第二末端，从而产生多个衔接子连接的靶DNA双链体，其具有共价连接在靶DNA双链体的每个末端的测序衔接子，其中每个衔接子的双链多核苷酸双链体区在其末端包含甲基依赖性内切核酸酶的识别序列的一部分，其中如果两个衔接子的双链体区共价连接在一起产生衔接子二聚体，则将形成甲基依赖性内切核酸酶的完整识别序列；(b)如果有任何衔接子二聚体，通过用甲基依赖性内切核酸酶消化，然后用一种或多种外切核酸酶消化，来除去所述衔接子二聚体。

在另一个实施方案中，所述方法包括：(a)提供多个测序衔接子，其中每个所述衔接子包含双链多核苷酸双链体区，其中所述双链多核苷酸双链体区在其末端包含甲基依赖性内切核酸酶的识别序列的一部分，其中如果两个衔接子的双链体区共价连接在一起产生衔接子二聚体，则将形成甲基依赖性内切核酸酶的完整识别序列；(b)将所述测序衔接子的双链体区共价连接至多个平端靶DNA双链体的第一和第二末端，从而产生多个衔接子连接的靶DNA双链体，其具有共价连接在靶DNA双链体的每个末端的测序衔接子；(c)如果有任何衔接子二聚体，通过用甲基依赖性内切核酸酶消化，然后用一种或多种外切核酸酶消化，来除去所述衔接子二聚体。

衔接子可以包含单链发夹区或可以是线性的。在一个实施方案中，每个所述衔接子包含单链多核苷酸发夹区和双链多核苷酸双链体区。在另一个实施方案中，每个衔接子是包含第一和第二多核苷酸链的线性多核苷酸，其中每个衔接子包含双链多核苷酸双链体区和3'突出端区，其中第一链包含3'突出端区并在3'末端或在3'末端附近包含对外切核酸酶消化具有抗性的修饰核苷酸(例如，硫代核苷酸)，并且作为多核苷酸双链体的一部分的第二链在5'末端或5'末端附近包含对外切核酸酶消化具有抗性的修饰核苷酸(例如，硫代核苷酸)。