[发明专利]从核酸测序制备物除去衔接子二聚体的方法

权利要求书

1.一种制备用于测序的靶DNA双链体的方法，所述方法包括：

(a) 提供多个测序衔接子，其中每个所述衔接子包含双链多核苷酸双链体区，其中所述双链多核苷酸双链体区在其末端包含甲基依赖性内切核酸酶的识别序列的一部分，其中如果两个衔接子的双链体区共价连接在一起产生衔接子二聚体，则将形成所述甲基依赖性内切核酸酶的完整识别序列；

(b) 将所述测序衔接子的双链体区共价连接到多个平端靶DNA双链体的第一和第二末端，从而产生多个衔接子连接的靶DNA双链体，其具有共价连接在所述靶DNA双链体的每个末端的测序衔接子；和

(c) 如果有任何衔接子二聚体，通过用甲基依赖性内切核酸酶消化，然后用一种或多种外切核酸酶消化，来除去所述衔接子二聚体。

2.根据权利要求1的方法，其中每个所述衔接子包含单链多核苷酸发夹区和双链多核苷酸双链体区。

3.根据权利要求1的方法，其中每个所述衔接子是包含第一和第二多核苷酸链的线性多核苷酸，其中每个衔接子包含含有双链多核苷酸双链体区的第一末端和含有第一链的3'末端和第二链的5'末端的第二末端，其中第一链包含单链3'突出端区，其包含位于3'末端或3'末端附近的硫代核苷酸，且第二链包含位于5'末端或5'末端附近的硫代核苷酸。

4.根据权利要求1的方法，其中每个所述衔接子中的双链多核苷酸双链体区包含含有5'末端的第一链，其杂交至含有3'末端的第二链，其中所述第一链包含位于5'末端的序列GG，其杂交至位于所述第二链3'末端的序列CC_Me。

5.根据权利要求1的方法，其中每个所述衔接子中的双链多核苷酸双链体区包含含有5'末端的第一链，其杂交至含有3'末端的第二链，其中所述第一链包含位于5'末端的序列TC，其杂交至位于3'末端的序列GA_Me。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)包括使用连接酶进行共价连接。

7.根据权利要求1的方法，其中所述靶DNA包含用未甲基化核苷酸合成的基因组DNA片段的拷贝。

8.一种制备用于测序的多核苷酸样品的方法，包括将测序衔接子共价连接到待测序的靶DNA双链体，其中用于测序的多核苷酸样品根据权利要求1的方法制备，并包含少于约1％的衔接子二聚体。

9.一种测序多核苷酸的方法，包括根据权利要求2制备用于测序的靶DNA双链体，

其中每个衔接子的单链发夹区包含引物结合序列，且

其中所述方法进一步包括：

(d) 使引物与引物结合序列杂交并用DNA聚合酶延伸所述引物，从而制备用于测序的引物延伸产物。

10.一种测序多核苷酸的方法，包括根据权利要求3制备用于测序的靶DNA双链体，

其中所述单链3'突出端区包含引物结合序列，并且其中所述方法还包括：

(d) 使引物与引物结合序列杂交并用DNA聚合酶延伸所述引物，从而制备用于测序的引物延伸产物。

11.用于多核苷酸测序的衔接子，其包含双链多核苷酸双链体区，其中所述双链多核苷酸双链体区在其末端包含甲基依赖性内切核酸酶的识别序列的一部分，其中如果两个衔接子的双链体区共价连接在一起产生衔接子二聚体，则将形成所述甲基依赖性内切核酸酶的完整识别序列。

12.一种测序多核苷酸的方法，其包括测序包含多个衔接子连接的DNA双链体的多核苷酸样品，所述衔接子连接的DNA双链体具有共价连接在靶DNA双链体的每个末端的根据权利要求11的测序衔接子，其中所述多核苷酸样品包含少于约1％的衔接子二聚体。