[发明专利]防止模板转换期间连环化的方法和组合物

说明书

提供了进行模板转换反应的组合物和方法，其可包括减少或消除模板转换寡核苷酸(TSO)的连环化。在一些实施方式中，组合物可包含位点特异性核酸切割酶、包括位点特异性核酸切割酶的识别序列的TSO——其中TSO在其3’端具有与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸互补的至少一个核苷酸——和在识别序列处切割TSO的位点特异性核酸切割酶。

交叉参考

本申请要求2016年8月18日提交的美国非临时申请序号15/240,166、2016年7月29日提交的美国临时申请序号62/368,656、2016年8月3日提交的美国临时申请序号62/370,469、2016年8月3日提交的美国临时申请序号62/370,501和2016年8月18日提交的美国临时申请序号62/376,493的权益，所有申请通过引用并入本文。

背景技术

在多种RNA测序(RNA-Seq)方法中，模板RNA被扩增。一种扩增方法利用逆转录酶的模板转换活性。在这种方法中，逆转录酶将一个或多个非模板核苷酸添加到模板cDNA的3’端上，并然后将模板转换成具有与已添加到cDNA的3’端的非模板核苷酸互补的5’序列的寡核苷酸。模板转换被描述在例如US 5,962,272、Zhu et al.(Biotechniques 2001 30:892–897)和图1中。模板转换方法导致cDNA在其3’端具有模板转换寡核苷酸的互补序列(complement)。cDNA可利用与模板转换寡核苷酸的互补序列杂交的引物以及另一引物(例如，随机引物、寡dT引物或基因特异性引物)而被扩增。

利用模板转换的方法的一个问题是，聚合酶可在3’端处在模板合成与非模板合成之间反复转换。具体地，逆转录酶可将一个或多个非模板核苷酸添加到转换寡核苷酸的互补序列上，这导致逆转录酶将模板从一种转换寡核苷酸转换成另一种转换寡核苷酸。这导致转换寡核苷酸的互补序列的多个拷贝被添加到cDNA的3’端上。这种cDNA——其在3’端含有模板转换寡核苷酸的互补序列的连环体(concatemer)——可导致非特异性背景(non-specific background)和浪费的并且因此高成本的测序能力。本公开提供了此问题的解决方案。

发明内容

除了其它方面，本文提供了组合物，其包含逆转录酶、包含位点特异性核酸切割酶的识别序列的模板转换寡核苷酸——其中模板转换寡核苷酸在其3’端具有能与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸杂交(即，互补)的至少一个核苷酸——和位点特异性核酸切割酶。

还提供了制备cDNA的方法。此方法可包括：获得包括上述组合物和RNA模板的反应混合物；和培育该反应混合物以产生在3’端包含添加序列的cDNA分子，该添加序列包含模板转换寡核苷酸的序列的互补序列。在此方法中，在(b)的培育期间，位点特异性核酸切割酶防止cDNA分子的3’端的模板转换寡核苷酸的双链形式的连环体。

还提供了试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括逆转录酶；模板转换寡核苷酸，其包含位点特异性核酸切割酶的识别序列，其中模板转换寡核苷酸在其3’端具有与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸互补的一个或多个核苷酸；和位点特异性核酸切割酶，其识别模板转换寡核苷酸中的识别序列。

在本方法中，逆转录酶将模板从RNA转换成模板转换寡核苷酸，以产生含有模板转换寡核苷酸的互补序列的cDNA。在模板转换寡核苷酸被复制到cDNA的3’端上后，模板转换寡核苷酸和/或模板转换寡核苷酸的互补序列然后被位点特异性核酸切割酶切割。这种切割防止模板转换寡核苷酸的互补序列的连环体形成。本公开的实施例部分(其结果显示在图4-6中)显示，这种方法在减少否则通过模板转换形成的各种长度的连环体所引起的背景非常有效。