[发明专利]防止模板转换期间连环化的方法和组合物

权利要求书

1.组合物，其包含：

(a)逆转录酶；

(b)模板转换寡核苷酸，包含位点特异性核酸切割酶的识别序列，其中所述模板转换寡核苷酸在其3’端具有能与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸杂交的至少一个核苷酸；和

(c)所述位点特异性核酸切割酶。

2.权利要求1所述的组合物，其进一步包含RNA模板。

3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述RNA模板是总RNA或聚A⁺RNA。

4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述RNA模板是来自哺乳动物的RNA。

5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述RNA模板包含5’修饰GMP帽。

6.权利要求5所述的组合物，其中所述5’修饰GMP帽是7-甲基鸟苷或亲和标签标记的GMP帽。

7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其进一步包含cDNA合成引物，其中所述cDNA合成引物是寡(dT)引物、随机引物、或转录物特异性引物。

8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其进一步包含具有不与所述RNA模板杂交的5’尾的cDNA合成引物。

9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述模板转换寡核苷酸是DNA-RNA嵌合体。

10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述模板转换寡核苷酸在所述位点特异性核酸切割酶的所述识别序列与其3'端处与所述模板cDNA链的3’端处的所述非模板核苷酸互补的所述至少一个核苷酸之间包含扩增引物序列、和任选地分子条形码序列。

11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述模板转换寡核苷酸在其3'端处包含3个核糖鸟嘌呤残基。

12.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶选自莫洛尼氏鼠白血病毒(M-MLV)、缺乏RNA酶H活性的M-MLV逆转录酶、人T细胞白血病毒I型(HTLV-I)逆转录酶、牛白血病病毒(BLV)逆转录酶、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶；和其变体。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶是热稳定的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶切割双链DNA。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶是热稳定的。

16.权利要求1至14中所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶在20℃至65℃范围内的温度下是活性的。

17.权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶选自限制性核酸内切酶；N-糖基化酶；裂解酶(N-糖基化酶-裂解酶)；核酸内切酶；cas9直向同源物；和Argonaut直向同源物。

18.权利要求16所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶能够在比模板转换寡核苷酸切割的反应温度高至少10摄氏度的温度下10分钟后被灭活。