[发明专利]二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法

说明书

本发明对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了多种MVD的变异体。然后，对于变异体评价对于异戊二烯等烯烃化合物的生成的催化活性，结果发现，通过152位的甘氨酸被替换成其他氨基酸，上述催化活性提高。另外表明，除了152位之外进一步74位的精氨酸和209位的苏氨酸各自被替换成其他氨基酸的MVD也具有高的上述催化活性。

技术领域

本发明涉及利用了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的烯烃化合物的制造方法。另外本发明涉及上述变异体及其制造方法，进一步还涉及编码上述变异体的DNA、和插入了该DNA的载体。另外本发明涉及利用导入了上述DNA或上述载体的宿主细胞的烯烃化合物的制造方法，进一步还涉及包含上述变异体、上述DNA或上述载体的用于促进烯烃化合物的生成的制剂。

背景技术

异戊二烯、异丁烯等烯烃化合物作为合成橡胶等各种合成聚合物的原料极为有用，这些化合物可以通过石油分馏这样的化学方法得到。

然而，即使在这样的化学方法中，其收率也低，花费制造成本，另外需要时间。进而考虑近来的环境问题，要求开发不浪费有限资源的、对环境温和的可持续的烯烃化合物的制造方法以代替化学方法。

鉴于这种状况，尝试了利用或改变微生物等的代谢途径来制造烯烃化合物。例如，开发了对参与甲羟戊酸途径的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶等导入变异，利用该变异酶的异戊二烯、异丁烯等的制造方法(专利文献1～3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/092567号

专利文献2：国际公开第2015/004211号

专利文献3：国际公开第2015/021045号

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术存在的课题而做出的，目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的酶。

用于解决课题的方法

本发明者们为了实现上述目的，构想了将以5-二磷酸甲羟戊酸为底物、由二磷酸甲羟戊酸脱羧酶参与的异戊烯基二磷酸的生成(参照下述式)应用于异戊二烯等烯烃化合物的制造。

即，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸中导入1个或多个变异，使该酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)的底物特异性从原来的针对5-二磷酸甲羟戊酸变更为针对3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸等，从而经过如下述式所示的反应而制造异戊二烯等。

因此，本发明者们从前在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了约200个二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体。然后，对于这些变异体，评价了对于以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的催化活性。

其结果发现，74位的精氨酸被替换成组氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HT209R)在约200个变异体的中出类拔萃地对于异戊二烯的生成显示极高的催化活性。

这次，本发明者们为了进一步获得对于异戊二烯的生成显示高催化活性的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体进行了深入研究，结果表明，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的152位的甘氨酸被替换成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(G152X)具有生成异戊二烯的高催化活性。令人惊讶地，在约200个变异体中，与通过将特定的2个部位各自替换成特定的氨基酸而唯一获得的R74HT209R同等的极高催化活性，能够通过将仅1个部位(152位)的氨基酸替换成其他氨基酸(半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)来实现。