[发明专利]用于产生双链梭菌神经毒素的方法

说明书

本发明提供避开活化步骤需要的适合用于重组产生双链梭菌神经毒素的方法、细胞和试剂盒，以及由此获得的适合用于治疗的双链梭菌神经毒素。

技术领域

本发明提供避开活化步骤需要的用于重组产生双链梭菌神经毒素的方法。

背景技术

梭菌属(Clostridia)细菌产生高度有效和特异的蛋白质毒素，这些蛋白质毒素可使它们所递送至的神经元和其他细胞中毒。这类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)及由肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的那些。

已知在梭菌毒素中有一些最有效的毒素。作为实例，肉毒梭菌神经毒素(botulinum neurotoxin)对小鼠的半数致死剂量取决于血清型在从0.5至5ng/kg的范围内。破伤风和肉毒毒素都通过抑制所影响的神经元功能，尤其是神经递质的释放来发挥作用。肉毒毒素在神经肌肉接头处发挥作用并抑制周围神经系统中的胆碱能传递，而破伤风毒素在中枢神经系统中发挥作用。

梭菌神经毒素通过蛋白酶解切割称为SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白发挥作用——参见Gerald K(2002)Cell and Molecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons,Inc.。首字母缩略词SNARE源自术语可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是胞内小泡融合从而通过小泡运输从细胞分泌分子所不可或缺的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，且对SNARE显示高底物特异性。因此，一旦递送至所希望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶即能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。

在自然界中，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，该单链多肽翻译后通过蛋白酶解切割事件修饰形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在通常称为活化位点的特异性切割位点，该位点位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。只有通过此活化事件，才能达到梭菌神经毒素的完全功效。两条链称为重链(H链)(其具有约100kDa的分子量)和轻链(L链)(其具有约50kDa的分子量)。H链包含N端易位成分(H_N结构域)和C端靶向成分(H_C结构域)。切割位点位于L链和易位结构域成分之间。在H_C结构域结合其靶神经元且所结合的毒素通过内体内化进入细胞之后，H_N结构域使L链跨内体膜易位，进入细胞质溶胶，L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

肉毒梭菌神经毒素以其引起松弛性肌肉麻痹和抑制胆碱能分泌的能力为人们所熟知。这些特性导致肉毒梭菌神经毒素用于多种医疗和美容流程，包括眉间线或运动过度面线、头痛、半面痉挛、膀胱过度活动、多汗、鼻唇线、颈肌张力障碍、眼睑痉挛、痉挛和多汗的治疗。

目前所有批准的含有BoNT的药物/化妆品制剂包含从梭菌菌株纯化的天然存在的神经毒素(在或的情况下为BoNT/A，在的情况下为BoNT/B)。传统的BoNT产品生产是通过培养肉毒梭菌后分离和纯化肉毒梭菌神经毒素复合物或复合的游离神经毒素来进行。肉毒梭菌是产芽孢细菌，因此需要笨重的特殊培养设备和设施。因此在异源宿主如大肠杆菌(E.coli)中重组产生BoNT可以是有利的。但是，重组制备梭菌神经毒素的限制步骤是活化步骤。