[发明专利]点击化学用于IHC和ISH测定中的信号扩增的应用

说明书

申请人已经开发了用于IHC和ISH染色的扩增系统和方法，其利用“点击化学”将报告子分子共价结合至组织。

工业适用性的声明

本公开在化学和诊断领域中具有工业适用性。

公开背景

免疫组织化学(IHC)是指使用对特定抗原特异性的抗体在生物样品中检测、定位和/或定量抗原(诸如蛋白)的过程。IHC提供了精确地确定特定蛋白位于组织样品内的位置的实质性优势。它也是检查组织本身的有效方式。原位杂交(ISH)是指检测、定位和定量核酸的过程。IHC和ISH两者都可以在各种生物样品(诸如组织(例如，新鲜冷冻、福尔马林固定，石蜡包埋的)和细胞学样品)上进行。无论靶标是核酸还是抗原，靶标的识别可以使用各种标记(例如显色、荧光、发光、辐射)来检测。为了在临床环境中稳健地检测、定位和定量靶标，扩增识别事件是期望的，因为确信地检测低丰度的细胞标志物的能力对于诊断目的变得越来越重要。例如，响应于单一抗原检测事件，在标志物的位点处沉积数百或数千个标记物分子，通过扩增增强检测该识别事件的能力。

不良事件经常伴随扩增，诸如作为增加的背景信号而显现的非特异性信号。增加的背景信号通过模糊可能与低、但临床上显著的表达相关的微弱信号而干扰临床分析。因此，尽管识别事件的扩增是期望的，但不增加背景信号的扩增方法是高度期望的。一种此方法是酪酰胺信号扩增(TSA)，其也被称为催化的报告子沉积(CARD)。美国专利号5,583,001公开了使用分析物依赖性酶活化系统检测和/或定量分析物的方法，所述系统依赖于催化的报告子沉积来扩增可检测的标记信号。通过使标记的酚分子与酶反应，增强CARD或TSA方法中酶的催化作用。利用TSA的现代方法有效地增加从IHC和ISH测定获得的信号，同时不产生显著的背景信号扩增(对于与酪酰胺扩增试剂相关的公开内容，参见例如，美国申请公开号2012/0171668，其以其整体通过引用并入)。这些扩增方法的试剂正被应用于临床重要靶标，以提供先前无法实现的稳健诊断能力(OPTIVIEW®扩增试剂盒, Ventana MedicalSystems, Tucson AZ, 目录号760-099)。

TSA利用辣根过氧化物酶(HRP)和酪酰胺之间的反应。在H₂O₂存在的情况下，酪酰胺被转化为高反应性和短寿命的自由基中间体，其优先与蛋白上富含电子的氨基酸残基反应。然后，可以通过各种显色显现技术和/或通过荧光显微术检测共价结合的可检测标记物。在高度重视空间和形态背景的固相免疫测定(诸如IHC和ISH)中，自由基中间体的短寿命导致酪酰胺与生成位点紧密靠近的组织上的蛋白的共价结合，给出离散和特异性的信号。

具有2015年2月20日的国际申请日的标题为“Quinone Methide Analog SignalAmplification”的共同未决申请PCT/EP2015/0533556描述了一种替代技术(“QMSA”)，其与TSA一样，可用于增加信号扩增而不增加背景信号。实际上，PCT/EP2015/0533556描述了新型醌甲基化物类似物前体和使用醌甲基化物类似物前体检测生物样品中的一种或多种靶标的方法。其中，检测方法被描述为包括使样品与检测探针接触、然后使样品与包含酶的标记缀合物接触的步骤。该酶与包含可检测标记物的醌甲基化物类似物前体相互作用，形成反应性醌甲基化物类似物，其靠近靶标或直接在靶标上结合生物样品。然后检测可检测标记物。