[发明专利]无加帽步骤的硫醇化寡核苷酸的合成

说明书

本发明在此描述了一种用于制备硫醇化寡核苷酸的合成方法，所述合成方法无需加帽步骤，因为硫化剂使未反应的5’‑OH基团加帽。

相关应用

本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2016年6月24日提交的美国临时专利申请号62/354,433的权益，所述专利申请的全部内容特此以引用的方式并入。

序列表

本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。创建于2017年6月20日的所述ASCII副本被命名为123429-00220_SL.txt并且大小为3,101个字节。

发明背景

寡核苷酸是可化学合成用于研究和医学目的短DNA或RNA寡聚体。通常通过逐步添加核苷酸残基以产生特定序列来制备寡核苷酸。硫醇化寡核苷酸的当前固相合成制造过程使用每个循环四个反应(即脱保护(例如，脱三苯甲基化)、偶联、硫化和加帽)的重复。设计加帽步骤以阻断在每个循环中未能与亚磷酰胺偶联的任何未反应的5'-羟基，因此失败序列不会进一步参与后续循环中的偶联反应来产生缺失失败偶联的核苷的杂质。加帽步骤通常使用乙酸酐与碱催化剂，如吡啶或N-甲基吗啉进行。

由于需要完成四个步骤中的每一个来将每个核苷酸添加至生长寡聚体，所以减少步骤的数量将减少每个核苷酸添加所需的时间的量以及减少完成寡核苷酸合成所需的试剂的量。因此，需要用于制备寡核苷酸的新的合成方法。

发明内容

本文中的本发明描述了一种使用每个循环三个反应(即脱三苯甲基化、偶联和硫化)而不是常规的每个循环四个反应的重复用于完全或部分硫醇化的寡核苷酸的固相合成制造方法。

通常，通过将连接至固体载体的生长寡聚体的最后一个核苷酸的游离5'-羟基与适当的亚磷酰胺偶联来将核苷酸添加至所述寡聚体链。偶联反应的低效将使一些5'-羟基在后续偶联反应中自由反应，从而产生缺失单个、但随机核苷酸的寡聚体的复杂混合物。因此，为了防止未反应的5'-羟基稍后反应，在硫化步骤之前或之后，经由使用加帽试剂如乙酸酐来使5'-羟基加帽。

出人意料地，本发明人开发了一种消除在硫化步骤之前或之后的加帽步骤的方法。特别地，与其用需要新引入至所述方法的试剂(例如乙酸酐)使未反应的5'-羟基加帽，本发明人出人意料地发现，在硫化步骤中产生的副产物可用于使未反应的5'-羟基加帽。可使这些副产物，或在某些情况下硫化剂本身(例如PADS)再循环穿过固体载体以使未能与亚磷酰胺偶联的5'-羟基加帽。未反应的5'羟基与硫化副产物反应，而无需单独的加帽步骤，并且在后续循环中不再可用于偶联。

对于完全硫醇化的寡核苷酸(即，一种仅包含硫代磷酸酯(–P＝S)键的寡核苷酸)，根本不需要加帽步骤，并且所述方法包括每个循环仅3个反应(脱保护、偶联和硫化)。

本文所述的方法还可用于制备部分硫醇化的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯(–P＝S)键和磷酸二酯(-P＝O)键。部分硫醇化的寡核苷酸常规地通过4-反应步骤循环制备，所述循环中的第三步骤是氧化或硫化，这取决于是需要–P＝O键还是–P＝S键。使用本文所述的方法可用于消除硫化步骤后的加帽步骤。然而，因为氧化步骤的副产物不能使未反应的5'-羟基加帽，所以在氧化步骤之后可能剩余残留量的未反应的5'-羟基。然而，对于包含少量–P＝O键(例如4个或更少)的部分硫醇化的寡核苷酸，在此所述的方法甚至可在氧化步骤之后没有加帽步骤的情况下使用。对于包含更大量的–P＝O键(例如5个或更多)的部分硫醇化的寡核苷酸，可使用本文所述的方法，但是可在每个氧化步骤后使用常规加帽步骤(例如用乙酸酐)。然而，在硫化步骤之后仍然不需要加帽步骤，无论存在多少–P＝O键。

附图说明

图1是3-步寡核苷酸合成方法的图。

图2是常规4-步寡核苷酸合成方法的图。应注意，硫化步骤可在常规的每个循环4个反应的方法中在加帽步骤之前或之后进行。