[发明专利]包含非手性3’-S-或5’-S-硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸合成

说明书

本发明涉及含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的制备方法，其中R¹同说明书和权利要求书中所定义。

本发明涉及寡核苷酸特别是含有硫代磷酸酯连接体(linkage)的寡核苷酸、特别是非手性硫代磷酸酯连接体的寡核苷酸的制备方法。

本发明特别涉及含有至少一个式(I)的非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的制备方法，

所述方法包括使含有式(II)的核苷间连接体的寡核苷酸在碘存在下反应的步骤，

其中碘的浓度是大约0.001M至大约0.01M；和

其中R¹是磷酸酯保护基。

寡聚脱氧核苷酸作为治疗剂的应用(其中将众所周知的Watson-Crick杂交原理应用于靶向互补RNA链)自从其在19世纪70年代末期出现以来，已取得了显著进步(P.C.Zamecnik,M.L.Stephenson,P Natl Acad Sci USA1978,75,280-284；S.T.Crooke,Antisense drug technology:principles,strategies,and applications,第二版，BocaRaton，FL：CRC Press，2008)。

随时间推移，已将几种类型的化学修饰引入合成的寡核苷酸中，为了例如延长其半衰期、改善药代动力学、提高RNaseH活性、降低毒性或提高错配识别。

最成功的修饰之一是硫代磷酸酯连接体的引入，其中将非桥接的磷酸酯氧原子之一用硫原子代替(F.Eckstein,Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009,10,117-121)。所述硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸显示提高的蛋白结合，以及对核分解降解显示明显更高的稳定性，并由此在血浆、组织和细胞中比未修饰磷酸二酯类似物显示实质更高的半衰期。所述保证第一代寡核苷酸疗法的研发，并打开了后代修饰例如锁核酸(LNAs)的大门。

然而，用硫代磷酸酯代替磷酸二酯连接体在磷原子处创造了手性中心。因此，直到现在，所有批准的寡核苷酸治疗剂是大量非对映异构体化合物的混合物，所述非对映异构体化合物可能具有不同(并可能相反的)物理化学性质。

为了降低所述寡聚脱氧核苷酸的非对映异构的复杂性，硫代磷酸酯内的硫原子理论上可从非桥连位置之一位移至核糖的桥连的3’-位。所述修饰使得围绕磷的取代方式对称，并由此除去手性中心，因此降低分子非对映异构的复杂性。虽然以前已将此类3’-脱氧-3’-巯基-和2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸(M.M.Piperakis,J.W.Gaynor,J.Fisher,R.Cosstick,Org.Biomol.Chem.2013,11,966-974；J.Bentley,J.A.Brazier,J.Fisher,R.Cosstick,Org.Biomol.Chem.2007,5,3698-3702；G.Sabbagh,K.J.Fettes,R.Gosain,I.A.O'Neil,R.Cosstick,Nucleic Acids Res.2004,32,495-501；A.P.G.Beevers,K.J.Fettes,G.Sabbagh,F.K.Murad,J.R.P.Arnold,R.Cosstick,J.Fisher,Org.Biomol.Chem.2004,2,114-119)引入到寡聚(脱氧)核苷酸中，但是该修饰既没有描述于治疗剂的情况中，也没有用于降低寡聚脱氧核苷酸硫代磷酸酯的非对映异构复杂性。

带有一个或多个修饰的2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸的较长寡聚脱氧核苷酸的合成通常通过固相寡核苷酸合成技术实现，所述技术涉及3’-巯基亚磷酰胺结构单元(参见上面的参考文献)。然而，当利用所述修饰的亚磷酰胺时，报道低的偶联效率，致使目标产物的产率低。因此，以前的优化努力通常集中于偶联条件(试剂浓度、偶联时间、活化剂或添加剂)，但是没有发现显著改善合成效率的一套通用条件。