[发明专利]核糖核酸(RNA)相互作用

说明书

本发明涉及用于分析核糖核酸(RNA)相互作用的方法，所述方法包括：a)在紫外线照射下使用加标签的可逆交联剂(优选加标签的补骨脂素)使至少一个RNA分子和/或至少一对RNA分子的碱基配对核苷酸交联；b)将一个或多个所述交联的RNA分子片段化；c)使用所述标签提取一个或多个所述交联的RNA片段；d)连接一个或多个所述交联的RNA片段，以产生一个或多个交联连接的RNA嵌合体；e)逆转所述剂与一个或多个所述RNA分子的交联；f)通过对一个或多个连接的RNA嵌合体分子或一个或多个连接的RNA嵌合体对测序来制备序列文库；以及g)分析序列文库以确定RNA相互作用。本文还公开了通过分析RNA相互作用并且将其归于临床现象来研究受试者的方法，或通过根据确定的RNA相互作用将功效评分归于药物的药物发现方法。

本发明涉及用于分析核糖核酸(RNA)相互作用的方法，所述方法包括使用加标签的可逆交联剂使至少一个RNA分子和/或至少一对RNA分子的碱基配对核苷酸交联；用于分析核糖核酸(RNA)相互作用的试剂盒，所述试剂盒至少包括所述加标签的可逆交联剂；使用所述方法和/或试剂盒研究受试者的方法；以及使用所述方法和/或试剂盒的药物发现方法。

发明背景

RNA与其自身以及与其他RNA碱基配对的能力对于其在体内的功能是至关重要的。RNA在其线性序列及其二级结构和三级结构中均携带信息。虽然已经在全基因组范围内绘制RNA二级结构上取得了显著的进展，但是理解RNA的不同部分如何相互作用以形成高级结构需要相当多的成对结构信息。RNA与其他RNA相互作用(如miRNA-mRNA相互作用和lncRNA-mRNA相互作用)的能力在转录后基因调控中起重要作用。然而，RNA相互作用网络的全局性流行和动力学及其对基因调控的影响仍然很大程度上是未知的。因而，绘制不同细胞状态下的RNA结构和相互作用物组对于扩展我们对RNA功能的理解是至关重要的。

为了鉴别哪两个RNA区彼此相互作用，我们需要空间连接信息以连接物理配对的核苷酸。很多RNA交联剂(包含亚甲蓝、UV和补骨脂素)已经被用于将RNA的远离的相互作用区彼此连接。然而，这些策略的读出通常是缓慢且冗长的。用于鉴别成对相互作用的可替代的策略已经利用序列突变，随后是结构探测以检测RNA内的碱基配对配偶体。这些方法具有较高的通量，但不适用于研究全基因组。最近的策略(如CLASH、Hi-CLIP和RAP)已经利用高通量测序以鉴别与特定RNA结合蛋白或RNA种类相关的RNA相互作用的亚群。基于最近邻位连接(RPL)的方法也已经被用于以非选择性方式鉴别转录物组中的主干。然而，RPL不利用交联来鉴别稳定的相互作用，并且主要限于绘制分子内的RNA相互作用。

我们在本文中公开了一种被称作补骨脂素交联的、连接的和选择的杂交体的测序(Sequencing of Psoralen crosslinked,Ligated,and Selected Hybrids)(SPLASH)的高通量方法学，所述高通量方法学在全基因组范围内以高灵敏度和特异性绘制体内成对RNA相互作用。将SPLASH应用于人类转录物组和酵母转录物组容许研究数以千计的长程分子内和分子间RNA-RNA相互作用的多样性和动力学。例如，这容许突出RNA类别的关键结构特征的分析，包含mRNA的模块化组织、其对翻译和衰变的影响、以及非编码RNA中长程相互作用的富集。此外，分子间mRNA相互作用被组织成网络簇，并且在细胞分化期间被重塑。另外，其允许鉴别数以百计的已知的和新的snoRNA-rRNA结合位点的鉴别，从而扩展rRNA生物发生的知识库。这些结果突出了RNA相互作用物组的未充分探索的复杂性，并且为更好地理解RNA组织如何影响生物学做准备。

发明陈述

根据本发明的第一方面，提供了一种用于分析核糖核酸(RNA)相互作用的方法，所述方法包括：

a.使用加标签的可逆交联剂使至少一个RNA分子和/或至少一对RNA分子的碱基配对核苷酸交联，以产生至少一个交联的RNA分子和/或至少一个交联的RNA分子对；