[发明专利]细胞穿透肽(CPP)-介导的EV加载

说明书

本发明涉及用药理学试剂加载细胞外囊泡(EV)的方法。本发明公开了使用非共价或共价加载方法将细胞穿透肽用作进入EV的载剂的用途。此外，本发明属于医学用途和包括此类药理学试剂加载EV的组合物。

技术领域

本发明涉及用药理学试剂加载细胞外囊泡(EV)的方法和此类EV用于治疗目的的用途。

背景技术

细胞外囊泡(EV)通过将其内容物(主要是RNA、蛋白质和脂质)呈递给靶组织中的受体细胞来调节正常生理学和病理学中的细胞间通信。已经在许多背景下研究了EV的修饰以掺入各种类型的药理学试剂，例如WO2013/084000，其公开了外泌体用于细胞内递送生物治疗剂的用途，或WO2010/119256，其描述了使用外泌体递送外源遗传物质。

EV作为药物递送媒剂的效用在例如基于核酸的药物(例如，siRNA)、靶向细胞内组分的基于大蛋白质的药物以及例如溶解性差或高毒性药理学试剂的情况下是不容置疑的。还已在一定程度上研究了用于更广泛的药理学试剂的EV介导的药理学试剂递送，例如WO2011/097480代表了用有机小分子化合物加载EV的典型方法。WO2011/097480描述了一种非常容易的方法，其中例如，依赖于药物向EV内的扩散，使用简单的共温育步骤将植物化学试剂姜黄素和白藜芦醇加载到EV中，在此期间，纯化的EV和游离药物(例如，姜黄素)在室温下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一起温育。虽然非常方便和直接，但将简单的药理学试剂加载到EV中的这种常规方法不是特别有效，导致药理学试剂的显著浪费，并且也非常难以控制。此外，它缺乏普遍适用性，因为一些药理学试剂仅仅使用共温育不会大量加载到EV中。其它人(例如，Fuhrman等人，《控释杂志(J.Control Rel.)》，2015)也评估了EV的透化作用，使用洗涤剂(例如，皂苷)作为提高在这种情况下光活性试剂卟啉的加载效率的方法。

最近的专利申请(WO2015/120150)还涉及用各种类型的抗癌药物(涵盖小分子试剂和大生物药剂)加载肿瘤来源的EV。然而，如本领域中通常的情况，关于如何加载外泌体的信息非常少，并且如果有可用的方法，它们很少用于载有药理学试剂的EV的加载和实际治疗应用。

发明内容

因此，本发明的一个目的是克服与将药理学试剂加载到EV中以用于随后的治疗、预防和/或诊断应用相关的上述问题。此外，本发明旨在满足本领域内的其它现有需求，例如以将大量药理学试剂加载到EV中，实现可控加载，并且提供具有可观的治疗潜力的药理学试剂加载EV。此外，本发明提供了一种将各种来源(小有机化合物、RNA治疗剂、肽和蛋白质等)的药理学试剂加载到EV中的普遍适用的策略，这是本领域所缺少的。

本发明通过利用细胞穿透肽(CPP)作为进入EV的药理学试剂的载剂实现了这些和其它目的。在一个方面，本发明涉及用于EV加载的方法，其包括将EV群体暴露于至少一种药理学试剂和至少一种CPP的步骤。药理学试剂和CPP可以共价缀合成单一缀合物，其中一种CPP载有至少一种药理学试剂。可替代地，CPP和药理学试剂也可以由于非共价相互作用而形成纳米颗粒复合物，所述非共价相互作用可以推测为例如疏水和/或静电和/或范德华相互作用。有趣的是，尽管CPP-药理学试剂缀合物可以以个体缀合物的形式存在，但它们也可以形成非共价纳米颗粒复合物。如上所述，如本文使用的术语药理学试剂囊括多种不同类型的分子，包含肽、基于核酸的试剂(例如，siRNA或mRNA)以及有机药理学试剂。

在另一方面，本发明属于通过加载EV源细胞用药理学试剂加载EV的方法。此类方法可以包括以下步骤：(a)将EV源细胞群体暴露于至少一种药理学试剂和至少一种CPP，和(b)收获由EV源细胞产生的EV，其中EV包括所述药理学试剂。

在某些情况下，根据本发明的加载方法可以有利地与电穿孔步骤组合，以便增加加载到EV中的药物的量。