[发明专利]用二价阳离子分离核酸和用阳离子螯合剂洗脱的方法

说明书

本发明涉及分离核酸的改进方法。特别地，所述方法包括在洗脱所述核酸之前使用包括二价阳离子的洗涤缓冲液。

本发明涉及分离核酸的改进方法。特别地，所述方法包括在洗脱所述核酸之前使用包括二价阳离子的洗涤缓冲液。

自从在临床和分子生物学实验室实践中建立核酸分析技术以来，与核酸纯化相关的方法已经经历了快速的技术发展。尤其是，非常关注提高核酸产率和纯度，同时还使过程流线型化和/或使其适用于自动化(例如使用液体处理系统)。

通常使用核酸分离的固相提取方法。在此类方法中，将样本中的核酸吸附到固体表面，洗涤以去除杂质，并且然后在溶液中从固相洗脱。利用这个原理的方法的最早实例之一在Gillespie和Vogelstein，1979(《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，76:615-619)中进行了描述，并且使用了硅质材料如细碎玻璃来吸附核酸和含有基本上离液的盐的缓冲溶液。类似地，Boom等人，1999(《临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)》，37:615-619)也描述了一种利用硅质基质和离液缓冲系统从复杂的生物样本如脑脊髓液和尿液中吸附和分离DNA的方法。此类核酸分离方法的一个缺点是核酸仅在结合缓冲液所提供的离液条件下保持吸附到固体表面。另外，保持与分离的核酸缔合的离液剂可能干扰敏感的下游应用(例如，酶促反应、核酸分析等)。

通常使用含有显著比例的与水混溶的有机溶剂(按体积计，通常>50％)的洗涤溶液从核酸和固体表面去除离液盐。然而，这些有机溶剂也可以以与其要去除的离液剂类似的方式抑制敏感的下游过程。因此，在洗脱吸附的核酸之前，必须去除有机溶剂以便最小化抑制下游过程的可能性，但是这样做会大大减慢过程并增加过程的复杂性。

基于使用非离液盐的方法描述于DE 19856064和US 2001041332中。在这些方法中，所谓的亲液盐(kosmotropic salt)用于促进核酸与硅酸盐表面结合，但是仍然存在与从系统中去除有机溶剂相关的不便。

相比之下，WO 9609379描述了承载带负电荷的羧基的磁性微粒和具有高比例聚乙二醇(即，非离液盐)的缓冲系统用于分离DNA的用途。与基于离液剂和亲液剂的方法一样，需要在洗涤缓冲液中使用有机溶剂以去除结合缓冲液中不需要的组分。WO 02066993中描述了类似的方法，其中具有磁性的纤维素衍生物与含聚乙二醇的缓冲剂结合使用以将核酸吸附到固体表面。

EP 0512767中描述了硅酸盐材料结合含有有机溶剂的缓冲系统使用，并且在这些系统中，组分的极性比在方法中起关键作用。同样，有机溶剂存在于洗涤缓冲液中，并且必须在洗脱吸附的核酸之前通过蒸发去除，否则可能会损害随后对纯化的核酸的分析/使用。

WO 0248164中描述了一种基本上不同类型的方法，所述方法使用所谓的电荷切换机制(例如，来自英杰公司(Invitrogen)的)。在这个方法中，使用离子交换系统将核酸与具有弱酸性pH的水性缓冲系统中的带正电荷的表面结合。在使用弱碱性条件洗脱结合的核酸之前，保持弱酸性pH并且然后从系统洗涤污染物。通过将净电荷为正电荷或中性的离子交换活性基团(例如，脂族或杂环氨基)引入系统，此类方法成为可能，这取决于培养基的pH。由于带负电荷的核酸与颗粒的带正电荷的表面的相互作用，核酸与固体表面发生结合。

基于离子交换的系统的一个问题是，因为核酸的分离仅基于电荷，所以具有净负电荷的任何其它大分子(在方法所使用的条件下)也可能与核酸一起被纯化。潜在的污染物包含蛋白质和多糖。另外，离子交换相互作用对高离子强度和结合缓冲液中去污剂的存在非常敏感，并且因此需要非常准确地设定结合条件。除了pH之外，需要仔细考虑如盐浓度等因素并且尤其是阳离子去污剂的量。这些考虑可能导致对用于消化初始样本材料的裂解条件的设计的妥协成问题。