[发明专利]单链RNA-编辑寡核苷酸

说明书

本发明涉及能够在真核细胞中在目标RNA中对目标核苷酸(腺苷)进行特异性编辑的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸自身不形成分子内发夹或茎环结构，其中所述寡核苷酸在目标RNA区域中待编辑的目标腺苷相对的位置处包括胞苷(非互补性核苷酸)或尿苷。

发明领域

本发明涉及医学领域。更具体地，涉及RNA编辑领域，其中RNA序列通过单链反义寡核苷酸靶向，以特异性地改正RNA序列中的突变。

背景技术

RNA编辑是真核细胞改变其RNA分子序列的天然过程，其常常以位点特异性的精确方式进行，从而将基因组编码的RNA谱库增加数个数量级。动物界和植物界当中真核物种的RNA编辑酶已得以说明，在从最简单的生命形式(例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans))到人的后生动物中，这些过程在细胞自我平衡的管理中发挥着重要作用。RNA编辑的例子有腺苷(A)到肌苷(I)的转化和胞苷(C)到尿苷(U)的转化，其分别通过称作腺苷脱氨基酶和胞苷脱氨基酶的酶发生。最广泛研究的RNA编辑系统是腺苷脱氨基酶。

腺苷脱氨基酶是多结构域蛋白质，其取决于所考察的酶而包括2-3个双链RNA识别结构域和一个催化结构域。识别结构域识别特定的双链RNA(dsRNA)序列和/或构象，而催化结构域通过核碱基的脱氨基化在或多或少预先确定的目标RNA的附近位置处将腺苷(A)转化成肌苷(I)。肌苷被细胞的翻译机制读取为鸟嘌呤，这意味着，如果编辑的腺苷在mRNA或前mRNA的编码区域中，其可以重新编码蛋白质的序列。

A到I的转化也可以在目标mRNA的5′非编码序列中发生，在原始起始位点的上游产生新的翻译起始位点，这产生了N-端延长的蛋白质，或者在转录物的3′UTR或其他非编码部分中发生，这可以影响RNA的加工和/或稳定性。此外，A到I的转化可以在前mRNA中的内含子或外显子中的剪接元件中发生，从而改变剪接的方式。作为其结果，可以包括或跳过外显子。腺苷脱氨基酶是称为作用于RNA的腺苷脱氨基酶(ADAR)的酶家族的一部分，其包括人脱氨基酶hADAR1、hADAR2和hADAR3。

已经描述了应用腺苷脱氨基酶使用寡核苷酸来编辑目标RNA(例如，Montiel-Gonzalez等人PNAS 2013，110(45)：18285-18290；Vogel等人2014.Angewandte Chemie IntEd 53：267-271；Woolf等人1995.PNAS 92：8298-8302)。Montiel-Gonzalez等人(2013)描述了使用基因改造的融合蛋白对目标RNA进行编辑，该融合蛋白包括hADAR2蛋白质的腺苷脱氨基酶结构域，其与识别boxB RNA发夹序列的噬菌体lambda N蛋白质融合。hADAR2的天然dsRNA结合结构域已被除去，以消除天然ADAR的底物识别特性，并将其用lambdaN-蛋白质的boxB识别结构域取代。作者生成了一种包括用于编辑的与目标序列互补的“向导RNA”部分的反义寡核苷酸，上述部分通过N-结构域-脱氨基酶融合蛋白与用于序列特异性识别的boxB部分融合。由此，精妙地显示出，向导RNA寡核苷酸忠实地将腺苷脱氨基酶融合蛋白引导至目标位点，在目标RNA中产生向导RNA-引导的位点特异性的A到I的编辑。Montiel-Gonzalez等人(2013)中公开的这些向导RNA长度大于50个核苷酸，这对于治疗应用来说通常过长(难以制造和进入细胞)。该方法在治疗设定中的缺点还在于需要有由噬菌体lambdaN-蛋白质的boxB识别结构域组成的融合蛋白，上述识别结构域通常与截短的天然ADAR蛋白质的腺苷脱氨基酶结构域融合。目标细胞需要用融合蛋白转导，这会是主要障碍，或者为进行表达，目标细胞需要用编码改造的腺苷脱氨基酶融合蛋白的核酸构建物转染。当编辑要在多细胞生物体中进行，例如在针对人类疾病的治疗中以改正遗传病时，后一种需求构成不小的障碍。