[发明专利]用于产生羟基酪醇的宿主细胞和方法

说明书

本发明提供了组合物，其包含：(a)第一宿主细胞，其能够产生L‑DOPA；和(b)经修饰的宿主细胞，其能够将L‑DOPA转化为羟基酪醇(HTy)；其中第一宿主细胞和第二宿主细胞中的任一者或两者是经遗传修饰的宿主细胞。

相关专利申请

本申请要求于2016年6月24日提交的美国临时专利申请第62/354,657号的优先权，其通过引用整体并入本文。

政府支持的声明

本文描述和请求保护的发明是利用美国能源部(U.S.Department of Energy)根据合同号DE-AC02-05CH11231提供的资金进行的。政府对本发明享有一定的权利。

发明领域

本发明属于羟基酪醇生产领域。

发明背景

芳环的羟基化是用于制备许多有价值的化合物的重要反应，包括用于治疗帕金森氏病的L-3,4-二羟基苯基丙氨酸(L-DOPA)、苄基异喹啉生物碱和褪黑素。与在有机溶剂中经常使用金属氧化剂的化学反应相比，微生物体对芳环的羟基化是一种令人关注且有前景的方法，其以高区域选择性在单步且温和的条件下合成所需产物。微生物芳环羟基化参与芳香族化合物的有氧代谢，并且在降解过程中主要通过加氧酶和酪氨酸酶完成，以减轻毒性或将其代谢成用作碳源的有机酸。

酪氨酸酶是属于3型铜蛋白的氧化还原酶，其包括血蓝蛋白作为氧载体(Olivares,2009；Robb,1984)。该酶涉及使用分子氧作为氧化剂的L-酪氨酸的多重氧化反应；第一氧化步骤是L-酪氨酸到L-DOPA的邻-羟基化，并且已知是最慢的步骤，以及第二氧化步骤是由邻二酚快速生成邻醌，随后是非酶促反应为多巴色素(一种黑色素途径的有色中间体)。酪氨酸向L-DOPA的微生物转化是缓慢的过程，并且使用酪氨酸酶时难以避免过度氧化成正醌。还原剂诸如抗坏血酸的使用增加了从发酵液中纯化产物的更多步骤。

L-DOPA是活细胞的重要化合物，特别是在动物中，因为它被用作许多神经递质的前体，并且在动物脑中，L-DOPA由酪氨酸羟化酶(TH)用四氢生物蝶呤(BH4)作为辅助因子合成(Kappock,Chem.Rev.1996；Fitzpatrick,Ann Rev Biochem 1999；Daubner,ArchBiochem Biophys 2011)。在氧化步骤期间使用蝶呤辅助因子是TH及相关酶诸如苯丙氨酸羟化酶(PAH)和色氨酸羟化酶(TPH)的独特特征(Pribat,J.Bacteriol.2010)，并且这有助于防止L-酪氨酸至邻醌产物的过度氧化，这是微生物中通过酪氨酸酶产生L-DOPA的一个问题(Maass,2003)。然而，由于微生物中辅酶BH4的无效性，尚未有将TH酶应用于微生物代谢工程的报道。BH4是动物中存在的特有辅助因子，并且尚无细菌系统利用BH4生物合成L-DOPA或相关代谢物的报道。

羟基酪醇(HTy)是高价值的化合物，对稳定且可持续生产高纯度HTy的需求日益增加。HTy是最强效的抗氧化剂之一，具有作为抗肿瘤剂、抗动脉粥样硬化剂、抗炎剂和/或抗血小板聚集剂的潜在的生物功能。它在诸如功能性食物、膳食补充剂、化妆品和动物饲料的产业中具有广泛的潜在应用。

目前，HTy由富集的橄榄提取物在化学或酶促水解后产生。然而，该方法难以应用于高纯度产物，因为提取物是具有类似结构的化合物的复杂混合物。

发明概述

本发明提供了组合物，其包含：(a)第一宿主细胞，其能够产生L-DOPA；和(b)第二宿主细胞，其能够将L-DOPA转化为羟基酪醇(HTy)；其中第一宿主细胞和第二宿主细胞中的任一者或两者是经遗传修饰的宿主细胞。在一些实施方案中，第一宿主细胞是第一经遗传修饰的宿主细胞，并且第二宿主细胞是第二经遗传修饰的宿主细胞。