[发明专利]能够检测密切相关的等位基因的多重核酸测定方法及其试剂

说明书

本发明披露了用于引物依赖性核酸扩增方法的多部分引物。还披露了多重测定方法、相关的试剂盒和用于此类方法的寡核苷酸。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年4月7日提交的美国临时申请号62/319,332的优先权。该申请的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及核酸扩增和检测测定，例如PCR扩增和检测方法，并且涉及用于此类方法的引物、反应混合物和试剂盒。

发明背景

长期寻找的医学目标是能够在极早期检测极其罕见的突变，该突变在临床样本中的存在可用于诊断癌症，确定预后并指示有效治疗的选择。相关体细胞突变的检测和定量评估有多种用途，这些用途包括：(i)在遗传更可能发生癌症的基因的患者中，在可治疗阶段检测癌症；(ii)检测良性癌细胞中的突变，这些突变表明它们现在可能转移；(iii)在治疗期间测量癌细胞的丰度；和(iv)确定在治疗期间是否出现耐药性癌细胞，使得可以调整治疗。进一步的目标是开发能够进行多重测定的方法，这些多重测定可以同时测量不同罕见突变的丰度。如果可以获得此类测定，癌症可能会从常常致命的疾病转变为可以通过频繁的测试结合个性化的治疗调整来控制的慢性病。

带动这些努力的是认识到无论癌细胞位于体内的哪个位置，它们都会经常分裂，经历细胞凋亡和坏死，因此来自那些癌细胞的基因组DNA片段存在于每个患者的血浆中。这一认识开辟了如下的可能性：通过使用从血浆中分离的DNA进行“液体活组织检查”，可以在非常早的阶段检测和定量指示癌症诊断、预后和治疗的罕见突变的存在。测定设计者面临的挑战是找到一种选择性检测和定量血浆DNA中这些罕见突变体序列片段的方法，尽管存在来自全身正常细胞的丰富相关野生型序列片段，并且尽管事实上虽然起源于不同的细胞，但不同相关突变通常发生在相同或相邻的密码子中。虽然复杂且昂贵，但用于检测血浆DNA中罕见突变体序列片段的“下一代”测序的成功已经说明了该方法的价值(参见，例如，Murtaza等人(2013)Nature[自然]497:108-112)。

基于核酸靶序列的指数扩增的分子诊断测定，例如聚合酶链反应，是廉价的并且足够灵敏以从少至单个模板分子产生信号。常规地，通过使引物足够长使得在扩增反应条件下，主要在引物-退火步骤期间，引物仅到达核酸链中的一个位置来获得特异性。为区分两种或更多种靶序列，通常使用等位基因-特异性杂交探针，例如分子导标探针。如果被研究的序列是等位基因，例如与另一等位基因(例如野生型(WT)变体)以混合物存在的单核苷酸多态性(SNP)，通过使用探针进行区分则具有约3％的实际检出限(等位基因选择性为在10,000个分子的替代等位基因的存在下不低于约300个靶等位基因分子)，这是由于常见等位基因的扩增倾向于压倒罕见等位基因的扩增。

研究人员已转向修饰扩增引物以改进扩增测定的选择性。具有高度等位基因选择性的引物使得突变体DNA序列的指数扩增成为可能，同时抑制存在的远更丰富的野生型序列的扩增，即使它们之间的差异是SNP。仅仅缩短常规扩增引物将改进其等位基因-选择性，但由于这种改进是以特异性为代价的，因此它对分析等位基因混合物的价值有限。已经开发了引物的其他修饰以改进它们的选择性同时保持特异性。一种此类的方法是ARMS(“扩增阻滞突变系统”)。ARMS引物具有与所研究的序列变体互补但是与另一种或更多种等位基因不匹配的3'末端核苷酸。参见Newton等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:2503-2516；和Ferrie等人(1992)Am.J.Hum.Genet.[美国人类遗传学杂志]51:251-262。ARMS依赖于某些DNA聚合酶的阻滞性质，即不延伸具有这种不匹配的引物-靶杂交体的趋势。ARMS已被证明可用于确定接合性(纯合WT、杂合或纯合突变体(MUT))，但它对于其他用途具有约1％(在10,000个分子的替代等位基因的存在下不低于约100个靶等位基因分子)的实际检出限。