[发明专利]能够检测密切相关的等位基因的多重核酸测定方法及其试剂

权利要求书

1.一种多重测定方法，其能够在10,000个拷贝的相关的野生型DNA靶序列的存在下在样本中扩增和检测至少两种不同的密切相关的、预期的罕见突变体DNA靶序列中的每一种的少至十个拷贝，其中这些突变体DNA靶序列与彼此以及该野生型DNA靶序列相差少至单核苷酸多态性，该多重测定方法包括：

(a)制备非对称引物依赖性扩增反应混合物，该混合物包括该样本；DNA聚合酶；脱氧核糖核苷三磷酸；扩增所需的其他试剂；四甲基氯化铵(TMAC)或能够增强独特的多部分引物的等位基因选择性的另一种霍夫迈斯特盐；可区分标记的均相荧光检测探针，该均相荧光检测探针对每种罕见突变体DNA靶序列的扩增产物是特异的；过量浓度的针对这些密切相关的突变体靶序列的反向引物；以及限制浓度的针对该每种预期的罕见突变体靶序列的独特的多部分引物，所述多部分引物具有与任何靶DNA序列不互补的至少一种独特的DNA序列，并且在由该反向引物引发的扩增子链中的所述独特的序列中的一种的互补物是该探针的靶，并且该独特的DNA序列对于要单独识别的每种靶序列或靶序列组是独特的，其中每种多部分引物的序列在5'至3'方向上包含通过延伸该反向引物复制的以下三种连续DNA序列：

锚定DNA序列，该锚定DNA序列足够长使得其能够在引物退火过程中与这些密切相关的突变体DNA靶序列和该相关的野生型DNA靶序列杂交；

独特的桥DNA序列，该独特的桥DNA序列至少六个核苷酸长，其在引物退火期间不与该独特的多部分引物预期的DNA靶序列杂交，不与任何其他密切相关的突变体靶DNA序列杂交，或在引物退火过程中不与该相关的野生型DNA靶序列杂交；和

独特的足DNA序列，该独特的足DNA序列7至14个核苷酸长并且与该预期的DNA靶序列完全互补，但与突变体DNA靶序列和该相关的野生型DNA序列彼此存在一个或更多个核苷酸不匹配，该一个或更多个核苷酸中的至少一个是3'末端核苷酸或3'倒数第二核苷酸，其中：

(i)如果该多部分引物的锚定DNA序列和足DNA序列都与其预期的DNA靶序列杂交，从而产生引物-靶杂交体，则该引物-靶杂交体在该多部分引物的5'至3'方向上包含：锚-靶杂交体、泡状物、和足-靶杂交体，所述泡状物具有24至40个核苷酸的周长并且由该靶DNA序列中的间插DNA序列形成，该间插DNA序列至少八个核苷酸长并且在引物退火期间不与该引物的桥DNA序列杂交，

(ii)该泡状物将足-靶杂交体与锚-靶杂交体分离，并且根据阈值C_T与使用常规引物发生的C_T相比延迟至少五个循环所证明的，该分离的足-靶杂交体是使得复制预期的靶DNA序列的可能性不大的弱杂交体，该常规引物不含任何桥DNA序列；

(iii)根据由至少十个热循环的阈值差异即ΔC_T所证明的，在PCR扩增期间，针对其预期的靶DNA序列的多部分引物将引发任何密切相关的突变体靶DNA序列或该相关的野生型靶DNA序列的复制的概率比引发其预期的靶序列的复制的概率低至少1,000倍；

(iv)产生扩增子链的多部分引物具有桥DNA序列和足DNA序列，这些桥DNA序列和足DNA序列与该扩增子链的互补链完全互补；和

(v)每种多部分引物的桥DNA序列的长度和序列，连同其预期的靶DNA序列的间插DNA序列的长度，产生了对一种仅含有十个拷贝的其预期的靶DNA序列的样本观察到的阈值C_T，该C_T将在指数扩增的60个循环中出现并且与从不含有拷贝的样本中观察到的C_T是可区分的；和

(b)重复地循环该反应混合物以扩增在该样本中存在的这些密切相关的罕见突变体靶DNA序列，并通过经由实时或端点检测测量来自每种可区分地标记的探针的荧光强度来检测那些DNA序列的存在；

其中所述多重测定方法用于非诊断和非治疗目的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中循环是聚合酶链反应(PCR)方法中的温度循环。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中对于至少一种预期的罕见靶序列，该多部分引物包含不与任何靶序列互补的、对于要单独识别的每种靶序列或靶序列组是独特的5'标签序列，并且在由该反向引物引发的扩增子链中的该5'标签序列的互补物是该探针的靶。