[发明专利]稳定的假型化慢病毒颗粒及其用途

说明书

本发明涉及一种获得包含异源目标基因的稳定的假型化慢病毒颗粒的方法，包括以下步骤：a)在合适的细胞系中转染至少一种质粒，其中所述至少一种质粒包含所述目标基因、rev、gag和pol基因和编码ERV合胞素的序列，其中所述rev、gag和pol基因是逆转录病毒基因；b)孵育a)中获得的转染细胞，使得它们在上清液中产生所述稳定的假型化慢病毒颗粒；和c)收获并浓缩b)中获得的稳定的慢病毒颗粒。本发明还涉及一种用慢病毒载体转导免疫细胞的方法，所述慢病毒载体用ERV合胞素糖蛋白假型化。该方法可在未刺激的血细胞或用IL7简单刺激的细胞上进行，并且所述细胞可以繁殖。获得的稳定的假型化慢病毒颗粒尤其可用于基因疗法。

技术领域

本发明涉及稳定的假型化慢病毒颗粒及其用途，尤其是用于治疗。本发明还涉及用于制备这种稳定的假型化慢病毒颗粒的方法。本发明还涉及在vectofusin存在下，用这种假型化慢病毒颗粒，优选以最小的或没有预活化，转导人外周血初始B细胞和单核细胞的体外方法。

背景技术

基因治疗方法经常受到重组病毒载体对靶细胞的低转导效率的阻碍。逆转录病毒载体，特别是基于人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒载体(LV)是用于基因疗法的有希望的介质。这些载体目前在临床应用中用于治疗各种疾病，如免疫缺陷、神经退行性疾病或神经系统疾病、贫血或HIV感染。

逆转录病毒载体的一些应用依赖于特异性靶细胞的离体转导，例如表达CD34标志物的淋巴细胞或造血干/祖细胞。LV用于转导T淋巴细胞以产生长寿命的CAR-T细胞，用于治疗癌症，例如难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)(Porter等，Science Transl.Med.7:303ra139 2015)。LV用于转导CD34+细胞用于遗传起源的各种免疫、血液、代谢或神经退行性疾病的自体基因疗法(Wagemaker G.HumGene Ther.2014Oct；25(10):862-5.doi:10.1089/hum.2014)。慢病毒载体是通用工具，其可以用各种病毒包膜糖蛋白假型化，从而赋予颗粒特定的细胞趋向性特征(Buchholz等Trends Biotechnol.2015Dec；33(12):777-90.doi:10.1016/j.tibtech.2015.09.008)。

使用重组慢病毒颗粒的一个限制因素是在重组慢病毒颗粒的生产过程中获得高感染性滴度的能力。避免这种限制的一种方法是浓缩纯化步骤中的病毒上清液。然而，取决于用于假型化病毒颗粒的包膜糖蛋白，对于一些LV难以建立纯化方案。因此，许多慢病毒载体制剂具有低滴度且转导效力有限。

另一个限制因素是难以转导原代细胞，因此它们必须常常被活化以被转导，从而失去其初始状态。

最后，另一个限制因素是慢病毒载体本身感染靶细胞的能力。几种包膜糖蛋白如VSV-G或RD114TR可用于假型化慢病毒载体，并且对靶细胞如CD34+细胞和原代血细胞具有可变的感染性。

合胞素是具有膜融合特性的内源性逆转录病毒(ERV合胞素)包膜糖蛋白(Dupressoir等,2005；Lavialle等,2013)。

专利申请EP2385058已经描述了由ERVW-1基因(ENSG00000242950；也称为合胞素-1或HERV-W)编码的人内源性逆转录病毒包膜糖蛋白的膜融合特性。所述申请描述了其通过形成合胞体在癌症治疗中的用途。