[发明专利]通过测序5-羟甲基化无细胞DNA的无创诊断

说明书

本文提供了羟甲基化无细胞DNA的测序方法。在一些实施方案中，方法包括：将亲和标记物添加到cfDNA样品中仅羟甲基化的DNA分子上，对标记了亲和标记物的DNA分子进行富集；以及测序所富集的DNA分子。

交叉引用

本申请要求美国临时申请系列2016年4月7日提交的第62/319,702 号、2017年1月9日提交的第62/444,122号和2017年2月21日提交的第62/461,712号的优先权，将这些申请通过引用全部并入。

背景

5-甲基胞嘧啶(5mC)形式的DNA修饰和最近鉴别到的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)代表了哺乳动物基因组中所发现的两种主要表观遗传标记，它们影响了从基因调节到正常发育的广范围生物学过程。检测无细胞DNA(cfDNA)中的异常5mC和5hmC变化可能代表了有吸引力的无创癌症诊断方法。cfDNA是在我们源自不同组织的血液中所发现的循环DNA，已被用于无创产前检查、器官移植诊断和癌症检测。相比于无细胞5mC DNA作为癌症诊断的生物标志的深入研究，无细胞 5hmC DNA还是尚未开发的，这主要是由于5hmC在人类基因组中相比于5mC的水平更低(是5mC的百分之一至十分之一)以及缺少灵敏的对微量cfDNA(通常每ml血浆中仅有几纳克)有效的低输入 (low-input)5hmC DNA测序方法。

概述

本文提供了循环无细胞DNA样品中羟甲基化DNA的测序方法等等。在一些实施方案中，该方法包括将亲和标记物添加到cfDNA样品中仅羟甲基化的DNA分子上，对标记了亲和标记物的DNA分子进行富集；以及测序所富集的DNA分子。

在一些实施方案中，该方法包括：将衔接物序列添加到cfDNA末端；将连接了衔接物的cfDNA与DNAβ-葡萄糖基转移酶和修饰有化学选择性基团的UDP葡萄糖一起孵育，从而将化学选择性基团共价标记到cfDNA中的羟甲基化DNA分子上；经环加成反应将生物素部分连接到化学选择性修饰的cfDNA上；通过与生物素结合的载体相结合，对生物素化的DNA分子进行富集；使用结合了衔接物的引物来扩增所富集的DNA；以及测序所扩增的DNA以产生多个序列读段(reads)。

还提供了一种方法，其包括：(a)获得包含循环无细胞DNA的样品，(b)富集样品中的羟甲基化DNA，以及(c)独立定量所富集的羟甲基化DNA中的核酸量，这些DNA映射(map)至一个或多个目标基因座的每一个。

由本方法所获得的序列能够用于例如各种疾病或病症的诊断、诊疗或预后等等。

还提供了各种组合物，包括包含了循环无细胞DNA的组合物，其中DNA中的羟甲基胞嘧啶残基都被修饰成包含捕获标记物。

本文阐述了本发明教导的这些及其他特征。

附图简要说明

本领域技术人员将理解，下文描述的附图仅仅用作说明性目的。附图并不旨在以任何方式限制本发明教导的范围。

图1A-1C：cfDNA中5hmC的测序。图1A：无细胞5hmC测序的一般程序。用Illumina衔接物连接cfDNA，在5hmC上用生物素标记以便用链霉亲和素珠进行牵出(pull-down)。通过从链霉亲和素珠直接PCR完成终文库。图1B：测序文库中映射到内标(spike-in)DNA 的读段百分比。误差条表示标准差(s.d.)。图1C：基因中无细胞5hmC 与输入(input)cfDNA比值的log2倍数变化的宏基因图谱，根据它们在无细胞RNA-Seq中的表达进行排名。