[发明专利]热稳定的蛋白酶及其制备和使用方法

说明书

本发明提供了蛋白水解酶变体，其相对于野生型蛋白酶地衣芽孢杆菌PWD‑1蛋白酶kerA表现出改善的热稳定性。蛋白酶变体通过成熟地衣芽孢杆菌PWD‑1蛋白酶kerA的至少一个氨基酸残基的突变而得到。变体蛋白酶用作动物饲料添加剂以改善动物饲料的消化性和/或营养价值。

相关申请的交叉引用

本申请是2016年4月27日提交的美国临时专利申请号62/328,051的非临时申请，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明公开的主题通常涉及源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的kerA蛋白酶的热稳定变体。本发明公开的主题还涉及编码所公开的蛋白酶的DNA，包括所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，及其制备和使用方法。

背景技术

酶通常用作动物饲料中的添加剂以改善消化性，从而使饲料更有效并增加其能量含量。具体地，蛋白酶有助于蛋白质消化，因为它们水解不易消化的蛋白质并将其分解成更容易利用的肽。然而，动物饲料加工过程中的热处理对蛋白酶作为饲料添加剂的开发和使用提出了重大挑战。在通常的饲料造粒工艺中，将饲料在约70℃-80℃的温度预处理，然后在80℃-85℃的温度范围内造粒。由于温度升高，酶通常不可逆地失去其酶活性。因此，提供在加工条件下具有改善的热稳定性的酶是有益的。

发明内容

在一些实施例中，本发明公开的主题涉及地衣芽孢杆菌kerA蛋白酶的多肽变体，其包括如下所示的序列(a)A298P：N322S：S363D(SEQ ID NO：1)、N322S(SEQ ID NO：2)、G222S：N265C：N322S(SEQ ID NO：3)、P145E：A298P：N322S：S363D(SEQ ID NO：4)、N322S：S363D(SEQ ID NO：5)、P145E：N322S(SEQ ID NO：6)、N265C：N322S(SEQ ID NO：7)、P145E：A298P：S363D(SEQ ID NO：8)、N265C(SEQ ID NO：9)、G222S：N265C(SEQ ID NO：10)、G222S：N227Y(SEQ ID NO：11)、N265C：G270R(SEQ ID NO：12)、P145E：S363D(SEQ ID NO：13)或G222S：N227Y：N265C：A298P(SEQ ID NO：14)；(b)如(a)部分所示的，并且在序列的其余部分具有至少70％序列同一性的变体序列，其中变体序列具有蛋白酶活性并且相对于地衣芽孢杆菌kerA蛋白酶保持增强的热稳定性；(c)如(b)部分所示的变体序列，其中至少70％序列同一性仅由保守取代组成；或(d)如(a)、(b)或(c)部分所示的变体序列的片段，其中所述片段具有蛋白酶活性并且相对于地衣芽孢杆菌kerA蛋白酶保持增强的热稳定性。

在一些实施例中，提供了编码变体蛋白酶的多核苷酸。

在一些实施例中，提供了核酸构建体或表达载体，其包括编码变体蛋白酶的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一种或多种控制序列可操作地连接，所述控制序列指导变体蛋白酶在表达宿主细胞中产生。

在一些实施例中，提供了重组表达宿主细胞，其包括编码变体蛋白酶的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一种或多种控制序列可操作地连接，所述控制序列指导变体蛋白酶产生。

在一些实施例中，提供了一种产生变体蛋白酶的方法，包括培养重组表达宿主细胞，所述重组表达宿主细胞包括编码变体蛋白酶的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一种或多种控制序列可操作地连接，所述控制序列指导变体蛋白酶在有利于产生变体蛋白酶的条件下产生。

在一些实施例中，提供了包括变体蛋白酶的动物饲料，其中变体蛋白酶以足以增强动物对饲料的消化性的量存在。

在一些实施例中，提供了包括变体蛋白酶的动物饲料添加剂。

附图说明