[发明专利]防止重结晶的冷冻保存培养基和方法

说明书

本发明涉及一种用于在非低温冷冻温度下保存细胞的培养基。该培养基包含亲水且无毒的聚合物或其他高分子、含水液体和冷冻保护剂。高分子的分子在溶解于所述含水液体中时形成形状为球形的致密的三维结构。本发明的培养基可以用于在非低温温度下长期贮存细胞，结果类似于在低温温度下贮存所见的结果。

对相关申请的交叉引用

本申请基于并要求2016年5月13日提交的美国临时申请序列号62/336,142的优先权，该临时申请通过引用并入本文。

发明背景

1.发明领域

本发明涉及低温生物学和冷冻保存领域。

2.相关技术的描述

目前细胞储液的长期贮存通常需要使用液氮(LN₂)，由于通常使用的含有细胞膜渗透性冷冻保护剂的冷冻保存培养基在非低温温度，例如-80℃下冷冻时是热不稳定的，在大多数实验室深度冷冻器提供的贮存条件下，导致冰重结晶并导致细胞存活力随时间逐渐丧失。细胞贮存对LN₂的依赖性显著增加运营费用，并引发了许多与工作效率和安全性受损相关的问题。

两种通用方法广泛用于冷冻保存：平衡(慢速冷冻)和非平衡(玻璃化)冷却程序。玻璃化方法及其“缓慢玻璃化”变型不仅引入由使用高浓度(通常40-50％v/v)的渗透性冷冻保护剂所致的细胞渗透损伤和毒性，而且需要供应LN₂或其他低温液体在低温温度，例如在1个大气压下的LN₂饱和温度(-196℃)或LN₂蒸汽(通常为-120℃)下实现和维持胞内和胞外溶液两者的玻璃化。对于慢速冷冻方法，首先将细胞加载相对低浓度(通常为10％v/v)的冷冻保护剂，然后缓慢冷却至中间非低温温度，例如在深度冷冻器中-80℃。在冷却期间，冰沉淀逐渐增加溶质浓度，使得在达到中间温度后，含有细胞的残留溶液高度浓缩并处于粘性液体状态。此类部分冷冻系统中的胞外冰是不稳定的，并且在冷却期间形成的小冰晶自发地开始合并并形成较大的晶体以使其表面能最小化并逐渐分布在整个样品中。此类事件，即所谓的重结晶对接触出现的大晶体的细胞造成严重的机械损伤，或者引入致命的胞内冰形成。尽管这种细胞破坏过程非常缓慢(通常在数周而不是数小时内发生)，但是即使在低至-80℃的温度下，它也是渐进的。许多出版物在科学研究文章或冷冻保存培养基产品手册中证明，目前在-80℃深度冷冻器中的贮存仅适用于临时或短期使用目的。因此，为了在-80℃缓慢冷冻细胞后实现细胞的长期贮存，必需进行将样品冷却至低温温度的第二步。

抗冻蛋白和某些小分子能够通过诱导热滞后来淬灭冰重结晶，但是此过程仅在刚好低于冰熔点的温度范围内发生并且在更低的温度下无效。

已经开发了各种聚合物和相关方法，以通过在液氮中贮存后增加溶液粘度或改善细胞膜稳定性来改善融解后细胞存活力和功能。然而，目前，通过使用这些聚合物和方法在-80℃长期贮存后，对于研究和生物医学应用两者非常有价值的许多细胞类型的低存活率尚未有显著改善。用于冷冻保存的这些广泛使用的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基淀粉(HES)等的应用不足以防止在非低温温度下冷冻保护剂溶液的重结晶。

发明概述

本发明涉及用于在非低温冷冻温度下保存细胞的培养基，其包含在溶解于含水液体中时形成形状为球形的致密三维结构的高分子。本发明还涉及包含本发明培养基的培养基-细胞悬浮液，其具有悬浮于培养基中的细胞。本发明还涉及使用本发明的培养基来保存细胞的方法。在非低温冷冻温度下，致密且球形的结构在具有细胞的培养基的未冷冻部分中浓缩，并且这种拥挤效应防止在非低温温度下贮存期间的冰重结晶。

在本发明的某些方面，培养基包括亲水且无毒的高分子、含水液体和冷冻保护剂。高分子在培养基中的浓度可以等于或大于约20％(w/v)、约25％(w/v)或更大、约35％(w/v)或更大或约50％(w/v)或更大。