[发明专利]用于将核酸引入细胞的方法

说明书

本发明提供编码SOCS1的核酸用于增强将至少一种感兴趣的核酸引入细胞的效率的用途；用至少一种感兴趣的核酸重复转染细胞的方法，其包括加入以下的步骤：a)编码SOCS1的核酸，并且同时或随后b)编码至少一种感兴趣的多肽的至少一种感兴趣的核酸，其中至少步骤b)重复至少一次；和用至少一种感兴趣的核酸电穿孔细胞的方法，其包括向所述细胞中加入以下的步骤：a)编码SOCS1的核酸，并且同时或随后b)所述至少一种感兴趣的核酸。所述至少一种感兴趣的核酸和所述编码SOCS1的核酸可以是mRNA，其中每种所述mRNA在其3’端具有包含至少200个腺嘌呤的聚(A)尾。

背景技术

核酸(例如DNA或RNA)的转染在细胞中引发所谓的先天免疫。细胞质蛋白识别非自身核酸并激活信号转导途径，导致特别是细胞因子的产生，并可导致细胞凋亡。被触发的一种信号传导途径是干扰素(IFN)信号转导途径。如果细胞被转染一次，这种效应对于细胞的存活并不重要。但如果细胞必须在几天内被反复转染，则观察到细胞死亡大大增加。通常，这导致转染细胞的细胞死亡。痘苗病毒可溶性α/β干扰素受体(B18R)与细胞表面结合并保护细胞免受IFN的抗病毒作用(Alcami等，2000，Journal of Virology，74：11230-11239)。在重复转染细胞后向细胞培养基中加入蛋白质B18R蛋白导致细胞死亡大大减少，转染基因表达增加。B18R蛋白质例如在每天进行用于通过重编程因子的mRNA将原代分化细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)的细胞转染后加入到细胞培养基中(Warren等，2012，SCIENTIFICREPORTS 2：657，DOI：10.1038/srep00657)。B18R作为蛋白质添加到培养基中，因此具有费力且昂贵的生产的缺点。通常纯化的蛋白质仍然被不需要的组分污染，例如内毒素，其不可以与蛋白质分离或只有通过巨大的努力才与之分离。另外，制备用于添加到另一环境例如细胞培养基中的蛋白质经常在估计新环境中的实际浓度时引起麻烦，因为蛋白质通常具有粘附在含有蛋白质的容器壁上的疏水区域。

Poleganov等(Hum Gene Ther 2015，26(11)，751-66)报道了各种病毒mRNA(B18R、E3和K3的痘苗病毒衍生mRNA)的组合，以拯救细胞免受先天免疫激活的不希望的影响。当与重编程相关微小RNA(miRNA)组合时，这产生无饲养iPS细胞产生方法。该方法的缺点是相当复杂的mRNA/miRNA混合物，其是促进重编程所必需的。

在Hong和Carmichael(2013，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，288：16196-16205)中，显示对I型IFN的减弱细胞应答可能是多能人干细胞的一般特征，并且这与细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的高表达相关。

已经描述了细胞内的大多数mRNA具有长度为50至150个核苷酸的聚(A)(Jalkanen，AL等，Semin Cell Dev Biol.2014；34：24-32)。

因此，一般的假设是，对于体外产生的mRNA，应该使用类似于细胞中发现的长度的聚A尾。尽管非常短的聚A尾与更快的降解相关，但已显示mRNA的翻译效率随着聚A长度在15至98个腺苷的范围内增加(Preiss，T等，RNA.1998；4(11)：1321-31)。通常，体外转录的mRNA的聚A尾长度在20至200个核苷酸的范围内。在Poleganov等的上述出版物中，所有mRNA都含有正好120A的聚A尾。

大肠杆菌聚(A)聚合酶是体外针对多聚腺苷酸RNA的最常见的酶，已被描述为产生具有仅20-150个核苷酸的聚A尾。当与Hfq蛋白组合时，已经描述具有至多900个核苷酸(Hajnsdorf E等，Proc Natl Acad Sci USA.2000，15；97(4)：1501-5.)。很少聚(A)聚合酶能够产生更长的聚(A)尾，例如酵母聚(A)聚合酶。

本领域需要一种改进的或替代的方法，用于将感兴趣的核酸分子引入细胞中，其减少细胞的所谓先天免疫的不希望的影响，所述影响可以通过将核酸引入细胞而发生。

发明内容