[发明专利]编码含报告分子、底物和去稳定化部分的多肽的重组多核苷酸，含其的宿主细胞及其用途

说明书

提供了编码包含报告分子部分、底物部分和去稳定化部分的多肽的重组多核苷酸，包含其的宿主细胞，以及通过其测量蛋白酶水平的方法。

技术领域

本公开涉及编码包含报告分子部分、底物部分和去稳定化部分的多肽的重组多核苷酸，包含其的宿主细胞，以及通过使用其使用重组多核苷酸测量蛋白酶水平的方法。

背景技术

蛋白酶是进行蛋白水解的酶。蛋白酶降解通过水解将多肽链中的氨基酸彼此连接的肽键。蛋白酶可包括神经毒素。肉毒杆菌和破伤风梭菌产生非常有效的神经毒素，例如肉毒杆菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素特异性结合神经元细胞并抑制神经递质的释放。一些蛋白酶(例如神经毒素)不仅具有非常强的毒性，而且还以非常少的量存在。因此，需要开发一种安全且准确地测量其活动的方法。

一方面提供了一种重组多核苷酸，其包含编码多肽的第一多核苷酸，所述多肽包括：报告分子部分；去稳定化部分；可操作地连接报告分子部分与去稳定化部分的底物部分，其中底物部分包括蛋白酶活性的切割位点。

另一方面提供了含有重组多核苷酸的宿主细胞。

另一方面提供了用于测定蛋白酶多肽的蛋白水解活性的试剂盒，该试剂盒包括由上述重组多核苷酸编码的多肽，以及测量由报告分子部分，内标报告分子或其产物发射的信号的检测剂。

另一方面提供了用于测定蛋白酶多肽的蛋白水解活性的试剂盒，该试剂盒包括含有上述重组多核苷酸的宿主细胞，以及测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物发射的信号的检测剂。

另一方面提供了测定样品中蛋白酶多肽的蛋白酶活性的方法，该方法包括：使重组多核苷酸编码的多肽与怀疑含有蛋白酶多肽的样品接触；以及测量由报告分子部分或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。

另一方面提供了测定样品中蛋白酶多肽的蛋白酶活性的方法，该方法包括：使宿主细胞与怀疑含有蛋白酶多肽的样品接触；以及测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。

另一方面提供了测定样品中蛋白酶多肽特征的方法，该方法包括使重组多核苷酸编码的多肽与蛋白酶多肽接触；测量由报告分子部分或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号；以及基于测量信号确定选自信号发射的起始时间和其持续时间中的一个或多个。

另一方面提供了确定样品中蛋白酶多肽特征的方法，该方法包括使宿主细胞与蛋白酶多肽接触；测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号；以及基于测量信号确定选自信号发射的起始时间和其持续时间中的一个或多个。

发明内容

第一方面提供了重组多核苷酸，其包括编码多肽的第一多核苷酸，所述多肽包括：报告分子部分；去稳定化部分；可操作地连接报告分子部分与去稳定化部分的底物部分，其中底物部分包括蛋白酶活性的切割位点。

关于重组多核苷酸，报告分子部分在由其催化的反应中可以是发射可检测信号的材料或释放发射可检测信号的材料(下文中也称为“产物”)。报告分子部分可选自荧光蛋白，β-内酰胺酶，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶，氯霉素乙酰转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，过氧化物酶和荧光素酶。荧光蛋白可选自GFP，YFP，Citrine，CFP，RFP，Kaede，PA-GFP，Emerald，Venus，DsRed，mHoneydew，mBanana，mOrange，tdTomato，mTangerine，mStrawberry，mCherry，mRasberry，mPlum，ZsGreen和ZsYellow蛋白质。

关于重组多核苷酸，与不存在去稳定化部分相比，去稳定化部分的特征在于降低细胞中第一多核苷酸的细胞内表达。表达可以是mRNA水平或蛋白质水平的表达。去稳定化部分可以促进细胞中第一多核苷酸在细胞内表达的mRNA或蛋白质的降解。去稳定化部分可以是PEST，CL1，或PEST和CL1的融合蛋白。