[发明专利]羟腈裂解酶

说明书

本发明提供一种获得来自除马陆(Chamberlinius hualienensis)以外的千足虫的HNL基因和HNL、提供可实用地使用的量的HNL的制备方法、使用了该HNL的光学活性氰醇的制造方法。一种来自千足虫的HNL基因的制造方法，其包含：从属于倍足纲(Diplopoda)的生物中存在的基因中，选择具有编码来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列TAX¹DIX²G(序列号15)或VPNGDKIH(序列号16)的碱基序列的基因。一种蛋白，其具有(1)～(3)中的任一个氨基酸序列且具有HNL活性，(1)序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列；(2)在(1)的氨基酸序列中具有氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列；或者(3)与(1)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。一种制备光学活性氰醇的方法，其中，使本发明的来自千足虫的HNL作用于含有醛等和生成氰化氢等的物质的反应溶剂。

技术领域

本发明涉及来自千足虫(millipede)的羟腈裂解酶(hydroxynitrile lyase，HNL)基因的克隆方法、通过这些基因的表达生产的酶、以及使用了表达酶的光学活性氰醇(cyanohydrin)的制造方法。

相关申请的相互参照

本申请主张2016年3月1日申请的日本特愿2016-038640号的优先权，其全部记载作为公开特别援引到此。

背景技术

光学活性氰醇是医药、精细化工的制造中重要的中间体。作为氰醇的制造方法，提出了使羟腈裂解酶作用于醛或酮和氰化物供体(cyanide donor)(专利文献1)的方法。从马陆(Chamberlinius hualienensis)中发现的(R)-羟腈裂解酶具有比从植物中发现的羟腈裂解酶更高的比活性和对热和pH的更优异的稳定性(专利文献2、非专利文献1)。

专利文献1：日本特开2000-217590号公报

专利文献2：日本特开2015-167477号公报

非专利文献1：Dadashipur等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.112，10605-10610(2015)

发明内容

发明所要解决的课题

专利文献2中，将从马陆中发现的(R)-羟腈裂解酶在酵母中表达，但其表达量为微量，未能构建大肠杆菌中的表达系统，其大量制备困难。

虽然推测其他的千足虫是否也具有羟腈裂解酶(HNL)，但未发现酶和酶基因，没有确立来自其他千足虫的HNL基因的克隆方法。

因此，本发明的目的在于提供一种能够获得(提供)来自除马陆以外的千足虫的HNL基因和HNL，进而能够确立得到的HNL的表达系统，提供实用上可使用的量的HNL的方法。此外，本发明的目的还在于提供使用了所提供的HNL的光学活性氰醇的制造方法。

用于解决课题的手段

本发明者们为了解决上述课题反复进行了深入研究。

本发明者们发现能够通过使用特定序列的缩聚引物，从来自千足虫的HNL基因间保守的序列克隆来自各种千足虫的HNL基因，并且通过该方法获得了来自各种千足虫的HNL基因和HNL。进一步发现，通过使用昆虫培养细胞和特定的大肠杆菌，可以表达新发现的HNL基因，制造HNL。此外，还发现通过使用所表达的HNL可以制造光学活性氰醇，从而完成了本发明。

本发明如下所述。

[1]一种方法，其为来自千足虫的羟腈裂解酶(以下称为HNL)基因的制造方法，其包含：