[发明专利]用于核酸序列的特异性靶向的二聚蛋白质

说明书

提供了多肽构建体，其包含连接至第二序列特异性DNA‑结合蛋白的第一序列特异性DNA‑结合蛋白，和使用所述多肽构建体的方法。

相关专利申请的交叉参考

本申请要求2016年4月29日提交的美国临时专利申请号62/329,740的优先权，该文通过引用方式纳入本文。

背景技术

Cas9或Cas9核酸酶指含Cas9蛋白的RNA引导的核酸酶。酶促活性Cas9包含Cas9的活性DNA切割结构域和向导RNA(gRNA)结合结构域。Cas9核酸酶有时也称作casn1核酸酶或CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)相关核酸酶。

CRISPR是适应性免疫系统，其提供针对可动遗传因子(病毒、转座因子和接合型质粒)的保护。CRISPR簇包含间隔子、与前述可动因子互补的序列，和靶入侵核酸。CRISPR簇可被转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)。在II型CRISPR系统中，前体crRNA的正确加工需要反式编码小RNA(tracrRNA)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA作为向导用于核糖核酸酶3-协助的前体crRNA的加工。随后，Cas9/crRNA/tracrRNA通过内切核苷酸方式切割与间隔子互补的线性或环状dsDNA靶标。不与crRNA互补的靶链首先通过内切核苷酸方式被切割，随后以外切核苷酸方式由3'-5'修整。自然中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和两种RNA。然而，单向导RNA可经工程改造，从而将crRNA和tracrRNA两者的方面引入单RNA物质。参见例如，Jinek M.，Chylinski K.，Fonfara I.，Hauer M.，Doudna J.A.，CharpentierE.Science 337:816-821(2012)。Cas9识别CRISPR重复序列中的短基序(PAM或前间区序列邻近基序)以协助区分自身和非自身。Cas9核酸酶序列和结构已见述于(参见例如，Ferretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；Mojica等，Microbiology155:733–740(2009)；Deltcheva E.等.，Nature 471:602-607(2011)；和Jinek M.等.Science 337:816-821(2012)。Cas9同源序列已见述于多个物种，包括但不限于，酿脓链球菌(S.pyogenes)和嗜热链球菌(S.thermophilus)。

不论CRISPR是用于基因组编辑、基因组靶向还是其它应用，普遍希望CRISPR系统特异性地靶向感兴趣的核苷酸序列，并避免基因组中的非靶(“脱靶”)序列。例如，Wang等，Nature Biotechnology 33:175–178(2015)显示，脱靶频率可能较高。该文章中，对于WASCR-4靶标的全部整合位点的脱靶整合为88％。中靶整合仅为12％。

阿尔古(Argonaute，“Ago”)蛋白也可用于靶向多核苷酸序列。例如，Ago蛋白普遍表达并结合至siRNA或miRNA，以通过使mRNA去稳化或通过翻译抑制来引导转录后基因沉默。Ago蛋白一般具有至少四个结构域：N末端结构域、PAZ结构域、Mid结构域和C末端PIWI结构域。参见例如，Hutvagner，Nature Reviews Molecular Cell Biology 9(1):22–32(2008)和Meister，Nature ReviewsGenetics 14:447–459(2013)。

定义