[发明专利]通过适体调节的聚腺苷酸化来调控基因表达

说明书

本发明提供了用于通过基于适体的U1小核核糖核蛋白(snRNP)介导的多腺苷酸化抑制的调节来调控基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。在包含效应区和适体的核糖开关的情形中，多核苷酸构建体含有U1结合位点，使得当适体结合配体时，发生靶基因表达。

发明领域

本发明提供了用于通过基于适体的U1 snRNP介导的多腺苷酸化抑制的调节来调控基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。在包含效应区和适体的核糖开关的背景中，多核苷酸构建体含有U1结合位点，使得当适体结合配体时，发生靶基因表达。

发明背景

真核细胞中的信使RNA(mRNA)通过广泛的转录后加工从前mRNA转录物产生，包括5'末端加帽，通过剪接去除内含子，以及3'末端切割和多腺苷酸化。通过剪接体进行剪接，剪接体是主要由核内小核糖核蛋白(snRNP)组成的大RNA-蛋白质复合物。主要的(U2型)剪接体含有U1、U2、U4、U6和U5snRNP，而丰度低得多的U12型剪接体由U11、U12、U4atac、U6atac和U5 snRNP组成。

几乎所有真核mRNA的3'末端包含聚(A)尾-具有20至250个腺苷残基的均聚物。通过切割和多腺苷酸化将聚(A)尾添加到细胞核中的前mRNA中，该过程是由大的蛋白质复合物催化的过程。在脊椎动物中，添加聚(A)尾部取决于两个顺式作用RNA元件，在聚腺苷酸化位点上游发现的高度保守的AAUAAA多腺苷酸化序列和在下游发现的保守性较差的富含GU的元件。向mRNA添加聚(A)尾部可保护其免于降解，以及其他功能。

已显示U1 snRNP通过抑制前mRNA的3'末端加工，抑制异常内含子多腺苷酸化信号，并确保启动子方向性，在前mRNA加工中具有剪接独立功能。例如，Fortes等人。(PNAS，100：8264-69，通过引用并入本文)，在3'UTR中放置一至三个U1结合位点，导致报告基因表达降低。

发明概述

在一个方面，本发明提供用于调节靶基因表达的多核苷酸盒，其包含核糖开关，其中核糖开关包含效应区和适体，其中效应区包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合位点互补的序列。在一个实施方案中，适体结合小分子配体。

在一个实施方案中，效应子序列除了包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合互补的序列之外还包括当适体结合配体时能够形成茎的额外序列。在一个实施方案中，效应区包含9至11个碱基对的茎形成序列。在一个实施方案中，效应区包含茎形成序列，其中茎中具有一个或多个错配碱基。

在一个实施方案中，U1 snRNP结合位点为8至10个核苷酸。在一个实施方案中，U1snRNP结合位点包含序列CAGGTAAG。在一个实施方案中，U1 snRNP结合位点选自CAGGTAAGTA、CAGGTAAGT和CAGGTAAG。

在一个实施方案中，多核苷酸盒包含两个或更多个核糖开关，其中每个核糖开关包含效应区和适体，其中效应区包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合位点互补的序列。在一个实施方案中，两个或更多个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。在一个实施方案中，两个或更多个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。

另一方面，本发明提供了一种调节靶基因表达的方法，包括：

(a)将一个或多个上述多核苷酸盒插入靶基因的3'UTR中，

(b)将包含多核苷酸盒的靶基因导入细胞，和

(c)将细胞暴露于配体，所述配体以有效增加靶基因表达的量特异性结合适体。

在一个实施方案中，配体是小分子。