[发明专利]使用双吡啶改善亲核物质的标记

说明书

双吡啶改善亲核物质的标记，包括胺和硫醇，并且对改善酸性和碱性标签的标记特别有用。与使用双吡啶的方案相比，双吡啶与此类标签一起使用显着增加了标记。然后能对经标记的亲核物质采用标准分析方法。

相关文献的交叉引用

本申请要求2016年2月26日提交的美国临时专利申请No.62/300,609的权益，以上内容通过引用并入本文并用于所有目的。

联邦资金的声明

不适用。

技术领域

本发明涉及通过亲电子标签改善亲核生物分子的标记的领域，尤其涉及标记糖胺(glycosylamines)。

背景技术

由真核细胞产生的许多蛋白质在翻译后通过添加共价连接、直链或支链的碳水化合物链进行修饰。这些蛋白质-碳水化合物偶联物被称为糖蛋白；连着碳水化合物的点称为糖基化位点。连着的多糖或寡糖称为聚糖。在特定糖蛋白的不同糖基化位点上发现了多种聚糖。特定糖蛋白上的聚糖的特定模式决定于产生该蛋白质的特定细胞系和该细胞生长的条件。

由于与蛋白质偶联的聚糖能影响对其功能至关重要的特征，包括药代动力学、稳定性、生物活性或免疫原性，在许多应用中确定存在哪些聚糖是重要的。因此，从蛋白质中除去一些或所有聚糖并分析聚糖以确定其组成的能力对确定糖蛋白是否具有其预期效果是有用的。例如，美国食品和药物管理局(“FDA”)要求对连接于生物制剂(诸如治疗性糖蛋白和疫苗)的碳水化合物进行表征以显示物质组成和制造的一致性，引起了广泛地对产品表征的需求。分析释放的碳水化合物谱对于重组蛋白质生产中的质量控制也是重要的，其中碳水化合物谱的变化可以指示系统中的压力、可能需要丢弃昂贵蛋白质的商业规模发酵罐的信号条件。因此，生物化学家、临床化学家和药物制造商对确定生物样品中，诸如治疗性糖蛋白，聚糖的分布特征具有相当大的兴趣。

聚糖通常以两种方式中的一种与糖蛋白连接。第一种方式中，称为N-聚糖，聚糖通过天冬酰胺残基上的N-糖苷键连接。第二种方式中，称为O-聚糖，聚糖与氨基酸残基上的氧原子连接。例如，N-乙酰基-半乳糖胺可以酶促连接到丝氨酸或苏氨酸残基的氧上。

N-聚糖可以通过各种酶，诸如PNGase F(肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶，EC 3.5.1.52.)的酶促切割从糖蛋白中酶促释放。在本领域中，通过酶从诸如糖蛋白的糖结合物释放聚糖有时称为“酶促消化”。N-聚糖的酶促消化(诸如通过PNGase F)通常在水溶液中发生，并且引起作为β-糖胺的N-聚糖的最初释放，其中释放的聚糖的游离还原端与氨偶联(参见，例如，Tarentino,et al.TIGG 1993,23:163-170；RasmussenJ.R.J.Am.Chem.Soc.1992,114:1124-1126；Risley,et al.J.Biol.Chem.1985,260:15488-15494,1985)。PNGase F-释放的N-聚糖最常通过还原胺化标记，其中聚糖的游离还原端与标签的游离氨基偶联，诸如荧光染料或电荷。根据所使用的标签，可以通过各种分析方法，诸如高效液相色谱(“HPLC”)、毛细管电泳(“CE”)、碳水化合物凝胶电泳或微流体分离来分析标记的聚糖。例如，在共同拥有的美国专利Nos.8,124,792和8,445,292中教导了N-聚糖的标记。

糖胺的稳定性取决于pH：较低的pH有利于糖胺快速水解成具有游离还原端的聚糖和铵(ammonium)，而更高的pH减缓糖胺的水解，这使得作为糖胺释放的聚糖被对氨基反应而不是游离还原端的试剂标记。因此，释放的糖胺在约pH 7.5至约pH 9的pH范围内更稳定且与标记性试剂更具反应性。不幸的是，许多与不同分析技术相容的胺反应性染料是酸性或碱性的，并且在低于6的pH的条件下更加稳定。在最有利于糖胺稳定性的条件与最有利于碱性或酸性染料稳定性的条件之间的存在分歧，这种分歧会导致通过酶促消化从糖蛋白释放的聚糖的不完全标记。

本领域仍然需要改善糖胺和其他亲核物质标记的组合物和方法。令人惊讶的是，本发明满足了这些需求和其他需求。