[发明专利]MDCK细胞的培养方法

说明书

本发明涉及使用微载体培养时的扩增倍率在4.5以上的克隆MDCK细胞及该MDCK细胞的培养方法、使用该MDCK细胞的培养方法使病毒增殖的方法。

技术领域

本发明涉及使用微载体的MDCK细胞的培养方法以及适于微载体培养的MDCK细胞。另外，本发明也涉及通过使用微载体培养MDCK细胞而实现的病毒增殖方法。

本申请请求通过参考援引于此的日本申请特愿2016-65251号作为优先权。

背景技术

近年来，在医药品生产或再生医疗等各种领域中,要求高效大量地培养细胞、组织、微生物等。尤其是为了实现生物医药品或再生医疗的实用化，细胞的大量培养技术的建立很重要。细胞的大量培养使得单克隆抗体、重组蛋白、膜蛋白、病毒等向规模化生产的转变成为可能，从而大大推进生物医药品等的实用化，备受期待。

作为具有粘着性的细胞的大量培养技术，已知有微载体培养法。微载体培养法是将细胞、培养液以及作为细胞的粘着骨架的微载体导入培养容器内，并间歇性地搅拌培养液，使悬浮的细胞和微载体接触，从而使细胞粘着在微载体的表面上的方法。通过该方法，使细胞在微载体的表面上增殖。微载体相对于体积比能够提供非常大的表面积用于细胞的粘着和增殖，从而适于细胞的大量培养。

作为利用细胞的大量培养技术的领域之一，可以举出疫苗制造。在疫苗制造中，在选择对于对象病毒具有敏感性的宿主细胞之后，使培养得到的大量细胞感染病毒，并使病毒增殖从而制造疫苗。由于疫苗的实用化需要大量的病毒，因而必须准备大量感染病毒的细胞。

流感是每年都在全世界流行的传染病，而且存在大流行的可能性，因而必须确保大量的流感疫苗。在流感疫苗的制造中，一直使用利用鸡胚蛋使流感病毒增殖的方法。在利用鸡胚蛋的制造方法中，由于原料采购或品质管理的难度较大，因而利用培养细胞使流感病毒增殖进行制造的方法不断得到实用。但是，培养细胞中病毒的增殖性差，对于迅速供给足够量的疫苗存在制约，这一情况作为问题备受关注。因此，当务之急是构建能够大量且迅速生产疫苗的系统。

流感疫苗的制造包括如下阶段，即：分离或制备流感病毒的病毒种株的阶段、准备所需量的用于使病毒种株增殖的鸡胚蛋或培养细胞的阶段、以及使用鸡胚蛋或培养细胞等使得到的病毒种株增殖的阶段。培养细胞可以在各个阶段中使用。作为流感疫苗的制造中使用的传统的培养细胞，可以举出Madin-Darby狗肾细胞(以下称为MDCK细胞)、非洲绿猴肾细胞(以下称为Vero细胞)等。Vero细胞是1962年从非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的肾脏上皮细胞分离和建立的，从20多年前开始用来制造针对脊髓灰质炎病毒或日本脑炎病毒等传染病的人用疫苗。Vero细胞对于大范围的病毒具有敏感性，也被使用于流感病毒的增殖中。MDCK细胞是1958年从正常的雄性可卡犬的肾脏建立的细胞，并在1968年由Gaush等人明确了其对于流感病毒的敏感性。通过向MDCK细胞的培养液中添加胰蛋白酶、葡萄糖、维生素等，其相对于流感病毒的敏感性提高，这一情况已被利用于各种流感病毒的分离中。

使流感病毒增殖的阶段中使用的MDCK细胞，正在尝试开发中。例如，专利文献1中公开了使MDCK细胞株(ATCC CCL-34)在无血清培养基中驯化，从而建立能够悬浮(浮游)培养的MDCK-33016株。另外，专利文献2和专利文献3中公开了从MDCK细胞(ATCC CCL-34)克隆能够复制低温适应性流感病毒的PTA-7909株和PTA-7910株。另一方面，经感染病毒的MDCK细胞会产生抑制病毒增殖的干扰素，因而与不会产生干扰素的Vero细胞相比，还具有不易使病毒增殖这一性质。

虽然微载体已被利用于细胞的大量培养，但很难说使用微载体的MDCK细胞的大量培养方法已建立。为了使MDCK细胞在微载体上呈现高增殖效率，要求细胞与微载体的粘着力要强。但是，通过在放大培养槽时反复进行细胞传代，细胞与微载体的粘着力变弱，这成为问题。进而，认为在使用微载体培养MDCK细胞时伴随着搅拌，因而细胞与搅拌叶片或培养槽壁等频繁接触，从而使细胞受到物理压力。由此，在使用微载体大量培养MDCK细胞时，细胞的增殖效率降低成为问题。