[发明专利]多路总抗体和抗体缀合的药物量化测定法

说明书

公开了检测，表征，测量，和量化临床前动物生物学样品，或人生物学样品(包括血浆/血清和组织样品)中可能存在的人和人源化抗体，和它们的缀合物的方法。

对相关申请的交叉援引

依照37 CFR§1.53(b)提交的此非临时申请要求2016年3月25日提交的流水号62/313,608的美国临时申请的依照35 USC§119(e)的权益，通过援引将其完整收录

发明领域

此公开涉及通过质谱术在非生物学或生物学基质中捕捉，检测，分析，表征，和量化抗体-药物缀合物，和它们的片段和代谢物的方法。

发明背景

随着brentuximab vedotin(商品名：)和trastuzumab emtansine(商品名：Genentech Inc.)的获批，提供药学活性药物或毒素分子对特定作用部位的靶向投递的抗体药物缀合物(ADC)的治疗性潜力得到确认，并导致进一步研究和开发。ADC一般由抗体，药学活性小分子药物或毒素(常常称作“有效负荷”)，和任选的连接二者的接头构成。接头(典型地是肽衍生物)连接小分子，高度有力的药物与大分子抗体，其选择或改造成靶向特定细胞类型(典型地是癌细胞)上的抗原。ADC如此采用单克隆抗体的强大靶向能力将高度有力的缀合的小分子治疗剂特异性投递至癌细胞。

随着成功的ADC候选物自正在进行的研究和开发程序浮现并行进至临床评估和市场销售，需要能有效评估通过组合大蛋白质复合物(抗体)和典型地小得多但高度有力的药物分子创建的复杂化学制品组合物的安全性和功效测定法。首先必须建立药物-抗体连接，抗体和药物浓度，以及药物-对-抗体比，和这些ADC组合物的稳定性的表征，然后监测一致性，因为ADC的这些特性会影响这些治疗性实体的生物活性，药动学，分布，免疫原性，安全性，和稳定性概况。

液相层析串联质谱术是用于非常复杂的基质(像血浆/血清/组织样品)中的蛋白质分析和定量的一种强大工具。由于源自消化感兴趣蛋白质和其它内源蛋白质的肽可能具有相同或相似的名义质量，MS片段化的第二维度常常提供感兴趣肽的独特片段。使用特定亲本肽和独特片段离子的组合来选择性监测要量化的分子。此类办法称作“多重反应监测”(MRM)，也称作选择反应监测(SRM)，它是用于蛋白质量化的一种常用模式。

概述

此公开的各个方面提供检测和量化总抗体和抗体缀合的药物数量的强健有力的方法，其通过消化抗体并分出ADC的药物成分，继以对所得组合物同时层析和质谱术分析组合的自消化抗体释放的药物和肽。

如此，在某些方面，此公开提供量化抗体缀合的药物和抗体-药物缀合物的总抗体浓度二者的方法。这些方法包括使抗体-药物缀合物(ADC)与还原抗体的组合物接触以形成变性抗体并消化变性抗体以形成单一分析样品中的消化抗体-药物缀合物肽混合物。然后可以通过LC-MS/MS分析单一分析样品中的消化药物和肽混合物以检测来自抗体的至少一种签名肽和药物。

在这些方法中，在ADC与还原抗体的组合物接触之前要在可以能在其中找到它的基质(诸如缓冲液，全血，血清，血浆，脑脊液，唾液，尿液，淋巴，胆汁，粪，汗液，玻璃状液，泪液，或组织)中直接分析ADC。在以对于充分分析而言太低的浓度在基质中找到ADC或在含有会干扰ADC的有效或精确分析的分子的生物学样品中找到ADC情况中，可以富集ADC，例如通过诸如大小排阻层析，透析，选择性沉淀，差速离心，过滤，凝胶电泳，液相层析，反相层析，免疫沉淀，包括蛋白A和蛋白G，NHS和链霉亲合素铁或磷或固定化抗体或凝集素的SpinTrap柱，顺磁性珠，免疫消减，分级，固相萃取，磷酸肽富集，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或脱盐等技术。如此，此公开的分析方法可以以结合至亲和捕捉介质的ADC，或其片段进行，这可以包括任选的清洗和洗脱步骤以进一步纯化或富集要分析的ADC，或ADC片段。