[发明专利]一种通过紫外分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法

权利要求书

1.一种通过紫外分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：

1)绘制ΔA和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线：向10mL比色管中依次加入1.0mL一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液，1.5mL浓度为2.0×10^-4mol/L的萘酚绿B溶液，1.50ml6.0×10^-2g/L的吐温20表面活性剂溶液，1.00ml pH4.50的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于80℃水浴加热8min，冷却至室温后于紫外分光光度计上，在体系的最佳波长478nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为A₀，含壳聚糖的溶液记为A，并计算ΔA＝A-A₀，建立ΔA与低分子量壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与中分子量壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与高分子量壳聚糖浓度的标准曲线C3；

2)10μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊，使用冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液；

3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔA和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，确定相对应的壳聚糖的分子量所使用的回归方程；

4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在478nm处测定其吸光度值A，并计算ΔA＝A-A₀，将ΔA代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验；

所述的醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH为4.50；步骤1)中溶液的加入顺序为首先加入壳聚糖标准溶液，其次加入萘酚绿B，再者加入吐温20表面活性剂溶液，最后加入醋酸-醋酸钠缓冲液；所述浓度为6.0×10-2g/L吐温20表面活性剂溶液加入量为1.50ml；冷却至室温至测定的时间为8min-2h；步骤1)标准曲线C1，C2与C3中壳聚糖的浓度范围1.0-4.0μg/mL。