[发明专利]一种利用水溶性苯胺蓝作为探针褪色分光光度法测定壳聚糖的方法

说明书

本发明公开了一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，属于大分子壳聚糖检测领域。本发明研究发现壳聚糖能与水溶性苯胺蓝结合形成离子缔合物，用分光光度计在614nm处测定其吸光度，壳聚糖浓度c在一定范围内与ΔA呈良好线性关系。该方法具有灵敏度高、简便、快速、准确等特点，可用于较复杂体系中壳聚糖的测定。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及壳聚糖含量测定技术领域，更具体地，涉及一种以水溶性苯胺蓝为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法。

背景技术

壳聚糖，化学名称为聚葡萄糖胺(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是一种在自然界中广泛存在于昆虫壳，虾壳，螃蟹壳、软体动物的骨骼和某些藻类等的骨骼中的天然高分子物质。随着不断的研究，人们发现壳聚糖具有的生物功能性即抗肿瘤，抗凝血，抗菌、减肥降脂和增强免疫力等功能，使之在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用得到巨大发展。因此，壳聚糖的准确定量显得十分重要，建立简便高效的方法测定壳聚糖含量有着重要的意义，这将进一步推进壳聚糖在各个领域的应用。

目前，国内外用于壳聚糖定量分析的方法主要集中在分光光度法和分子荧光法。共振瑞利散射法应用于壳聚糖定量分析的研究很少。目前，光谱分析法定量分析壳聚糖普遍忽视了壳聚糖作为高分子天然产物，其相对分子质量可能从几千到百万不等，当未知样品中壳聚糖相对分子质量与壳聚糖标准差异较大时，可能会产生一定的系统误差，影响准确定量，而此方面研究目前还处于空白。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种利用水溶性苯胺蓝为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法。通过以下技术方案予以实现：

本发明研究发现水溶性苯胺蓝是一种阴离子染料，在酸性条件下水溶性苯胺蓝与壳聚糖发生离子缔合反应，其离子缔合物在614nm处产生梯度比较好的吸收峰，且在0.001～8.00μg/ml范围内，吸光度的减少程度与壳聚糖含量呈线性关系线性方程为：ΔA＝-0.0683c+0.6166，R²＝0.9969。检出限0.090μg/ml。

本发明所涉及的一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，包括如下步骤：

标准曲线的绘制：配置一定浓度的壳聚糖溶液，按先后顺序加入甘氨酸-盐酸缓冲液、水溶性苯胺蓝(AB)操作液，再分别加入体积成梯度的壳聚糖溶液和1个空白试剂，混合均匀后定容，得到稀释后的成浓度梯度的壳聚糖待测溶液。室温下反应一段时间，以水为参比，在紫外分光光度计上614nm波长处检测壳聚糖待测溶液吸光度A_i和试剂空白的吸光度A₀，计算ΔA＝A₀-A_i。绘制标准曲线，进一步得线性方程；

样品检测：加入甘氨酸-盐酸缓冲溶液、水溶性苯胺蓝(AB)操作液，再加入初步处理后的待测样品溶液，混合均匀后定容匀，室温下反应，记录吸光度值，由上述线性方程计算出待测样品中壳聚糖的浓度。

优选的，所述一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，甘氨酸-盐酸缓冲溶液的pH值为2.50。

优选的，所述一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，水溶性苯胺蓝溶液的浓度为2.00×10^-5mol/ml。

优选的，所述一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，室温反应时间为10min。

优选的，所述的一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述壳聚糖的浓度范围0.001-8μg/ml。

更优选的，所述的一种水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于包括如下步骤：