[发明专利]一种利用水溶性苯胺蓝作为探针褪色分光光度法测定壳聚糖的方法

权利要求书

1.一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

标准曲线的绘制：配置一定浓度的壳聚糖溶液，按先后顺序依次加入甘氨酸-盐酸缓冲液、水溶性苯胺蓝操作液，再分别加入体积成梯度的壳聚糖溶液和1个空白试剂，混合均匀后定容，得到稀释后的成浓度梯度的壳聚糖待测溶液；室温下反应一段时间，以水为参比，在紫外分光光度计上614nm波长处检测壳聚糖待测溶液吸光度A_i和试剂空白的吸光度A₀，计算ΔA＝A₀-A_i，绘制标准曲线，进一步得线性方程；

样品检测：加入甘氨酸-盐酸缓冲溶液、水溶性苯胺蓝操作液，再加入初步处理后的待测样品溶液，混合均匀后定容匀，室温下反应，记录吸光度值，由上述线性方程计算出待测样品中壳聚糖的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述甘氨酸-盐酸缓冲溶液的pH值为2.50。

3.根据权利要求1所述的一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述水溶性苯胺蓝溶液的浓度为2.00×10^-4mol/ml。

4.根据权利要求1所述的一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述室温反应时间为10min。

5.根据权利要求1所述的一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述壳聚糖的浓度范围0.001-8μg/ml。

6.根据权利要求1所述的一种利用水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述反应后测定的时间为10min-5h。

7.一种水溶性苯胺蓝作为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)标准曲线的绘制：取10ml比色管，按先后顺序均加入pH2.50的甘氨酸-盐酸缓冲液2.00ml，水溶性苯胺蓝操作液1.00ml，向比色管中加入一定浓度的高黏度壳聚糖操作液和1个空白试剂，混合均匀后定容，得到稀释后的成浓度梯度的壳聚糖待测溶液；室温下反应一段时间，以水为参比，在紫外分光光度计上614nm波长处检测壳聚糖待测溶液吸光度Ai和试剂空白的吸光度A₀，计算ΔA＝A0-Ai，绘制标准曲线；使用中黏度壳聚糖溶液替换高黏度壳聚糖溶液，建立ΔA与中黏度壳聚糖溶液的标准曲线；使用低黏度壳聚糖溶液替换高黏度壳聚糖溶液，建立ΔA与低黏度壳聚糖溶液的标准曲线；使用样品工作液替换高黏度壳聚糖溶液，建立ΔA与样品工作液的标准曲线；

根据样品的ΔA和样品工作液的标准曲线的回归方程并将其与不同黏度的壳聚糖标准曲线比较，确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；

2)样品检测：准确称取0.0400g样品溶于0.5mol/L的HAc溶液中，于容量瓶定容至100ml，得到标准样品的贮备液；取一定量贮备液于离心机6000r/min离心10min，吸取离心后的样品壳聚糖标准贮备液2.50ml于100ml的容量瓶中，以水定容到刻度，得待测样品液；

向比色管中加入pH2.50甘氨酸-盐酸缓冲溶液2.00ml、2.00×10^-4mol/L水溶性苯胺蓝操作液2.00ml，再加入初步处理后的待测样品溶液，混合均匀后定容，室温下反应10min，与紫外分光光度计内614nm波长处检测，记录吸光度值A，并计算ΔA＝A0-A，将ΔA代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量。