[发明专利]用于检测老鼠肉的引物和探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测老鼠肉的荧光PCR引物和探针，以及试剂盒和方法。本发明采用依赖深海火球菌RNase H2酶的荧光PCR方法，同时对引物进行非常规设计以提高PCR反应的特异性，从而使得采用本申请的荧光PCR引物和探针及方法可以精确地扩增出MUS(NC‑005089.1)基因的序列，从而准确地判断出样品中是否含有老鼠肉，并显著提高荧光PCR体系检测的特异性，为食品卫生监测提供强有力的支持。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是用于检测老鼠肉的引物和探针、试剂盒及方法。

背景技术

现代食品产业的分工越来越细，链条越来越长，掺假的机会变多, 用非食用肉类伪装食用肉类，给消费者带来潜在风险。肉类掺假并非常规检测项目，也缺乏公开的数据支持，因此目前很难从整体上判断国内肉类产品到底掺假情况。

线粒体是真核生物呼吸作用的主要细胞器，线粒体拥有独立的基因组，典型的动物细胞的线粒体通常长度在16000个碱基左右，编码13个蛋白质，2个核糖体RNA和二十个tRNA。线粒体基因的几个特点使得其基因常用语物种鉴定。第一，一个细胞中含有几十到上千个线粒体，所以线粒体的基因容易被扩增。第二，线粒体是母系遗传，每种基因只有一个拷贝，容易确定序列。第三，线粒体基因进化压力小，变异快，有利于根据基因来区分无物种。

基因鉴定的方法主要是聚合酶链式反应方法，俗称PCR方法。按PCR的发展历史来看，经历了以凝胶电泳为基础的PCR阶段，到以荧光PCR为中心的阶段。目前主流的方法，是采用常规的荧光PCR，效果较好。现有技术检测的长期实践中，发现在试剂应用中，荧光PCR做肉类鉴定的特异性不足是主要问题。即使科学的设计了针对某种肉类的探针和引物，但是对其他肉类还可能出现低程度的交叉反应，给检测判定带来难度。另外由于现场检测的条件不够完善，基层工作人员的经验不足，对将非特异信号判别成阳性信号。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可准确地检测老鼠肉的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在一个方面，本发明提供了用于检测老鼠肉的荧光PCR引物和探针，所述引物和探针碱基序列如下：

mus引物F1：5’-ATTCCGCCCAATCACtCAAAddW-3’(SEQ ID NO.1)；

mus引物R1：5’-TTGGCCTCCGATTCATGTtAAGAddW-3’(SEQ ID NO.2)；

Mus探针P1：5’-TACTGAATTCTAGTAGCCAAC-3’(SEQ ID NO.3)；

其中，t代表胸腺嘧啶核糖核苷酸，T代表胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，ddW 代表双脱氧核糖核苷酸，探针P1的5’端结合荧光报告基团，探针P1的3’端结合荧光淬灭基团。

应当说明的是，所述W可以是A、T、C或G；其中，3’末端的双脱氧核糖核苷酸不能进一步被DNA聚合酶延伸。因此，该结构能有效防止引物二聚体等非特异产物的生成，显著降低了非特异信号。

在引物F1和R1的3’端的第六个核苷酸是核糖核苷酸，而不是脱氧核糖核苷酸。单独的引物并不会被深海热球菌的RNase H2识别并结合；当引物与模板在退火温度结合并正确配对后，引物-模板复合物中的3’端第6个核糖核苷酸才被深海热球菌RNase H2识别，切割，形成了正常的引物-模板复合物，PCR 的延伸反应才会起始。

上述两个特别结构有效的降低了非特异扩增，PCR反应的特异性提高了 30～100倍。

优选地，所述荧光报告基团为VIC，所述荧光淬灭基团选为BHQ或/和 MGB。