[发明专利]弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii)呈全球性分布、几乎感染所有恒温脊椎动物的细胞内寄生原虫，导致严重的人兽共患病。全世界约有1/4的人口感染弓形虫，我国人群平均感染率为7.9％，犬、猫等宠物感染弓形虫也非常普遍，可造成动物流产或感染后不发病而成病原携带者，成为人类感染弓形虫病的重要传染源。对于免疫抑制患者、免疫功能受损及缺陷患者，弓形虫感染最常见的表征是先天感染中发生的脉络膜视网膜炎以及像晚期AIDS等免疫缺陷患者发生的脑炎。孕妇感染后，则会造成畸胎、死胎或引发婴儿先天性弓形虫病，危害较大。

据统计，1985-2006年期间，我国犬弓形虫感染率在0.66％-62.3％之间不等，猫弓形虫感染率在14.06％-78％，常形成局部暴发流行。严重影响畜牧业发展且威胁人类健康。

传统弓形虫检测方法主要有：直接涂片或组织切片法、组织培养法、动物实验法、酶联免疫吸附等。直接涂片或组织切片法虽然简单快速，但漏诊率高；组织培养和动物实验最真实可靠，但操作烦琐，耗时长，成本高；酶联免疫吸附法简便，快速，敏感性尚可，但由于个体免役系统的差异，有时指标不能真实反映虫体感染的情况，可能造成漏诊或误疹。

目前，已有少数针对弓形虫核酸的检测方法，主要包括PCR技术和实时荧光定量PCR技术，对弓形虫的检测灵敏度和特异性有了很大提升。但PCR技术和实时荧光定量PCR技术均涉及变温步骤，或较高温度，这需要提取DNA的步骤，且需要配备价格高昂的PCR仪或实时荧光定量PCR仪，耗时较长、操作技术要求较高。目前分子诊断行业的发展趋势是实现简单、快速、准确、高灵敏度的检测。

中国专利CN201610867186.X，公开了一种弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒，其所述检测方法需要另外进行核酸提取步骤，且检测步骤较为复杂，容易造成气溶胶污染，引入假阳性风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法，特异性强、准确率高，操作简单、时间短、仪器要求低，能够实现快速、准确、低成本地检测弓形虫。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：弓形虫核酸快速检测引物组，包括检测弓形虫基因组B1基因序列的上、下游引物和探针；

所述上游引物是：5’-TTGCTGTTCTGTCCTATCGC-3’；

所述下游引物是：5’-ATGTTGCATTCTTCAGCCGTCT-3；

所述探针是：TCCCATGAAGTCGACCACCTGTTTCCTC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1d T/TCACTGTCA-C3 Spacer。其中：“i6-FAMdT”是6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”是带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“C3Spacer”指3’羟基封闭。

所述上、下游引物和探针可以是与权利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列碱基互补的序列。

本发明还提供弓形虫核酸快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：

(1)裂解液；

(2)稀释液；

(3)含引物的冻干酶管；所述引物为检测弓形虫基因组B1基因序列的上、下游引物和探针；

所述上游引物是：5’-TTGCTGTTCTGTCCTATCGC-3’；

所述下游引物是：5’-ATGTTGCATTCTTCAGCCGTCT-3；

所述探针是：TCCCATGAAGTCGACCACCTGTTTCCTC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1d T/TCACTGTCA-C3 Spacer；

(4)阳性对照品；

(5)阴性对照品。

其中，所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含0.1-2M的KAc 100ul、0.1-2M的KOH 120ul、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 250ul、水30ul。

优选的，所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含1.5-2M的KAc100ul、0.5-1M的KOH 120ul、1-2M pH8.0的Tris-Ac 250ul、水30ul。