[发明专利]弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.弓形虫核酸快速检测引物组，其特征在于，所述弓形虫核酸快速检测引物组包括检测弓形虫基因组B1基因序列的上、下游引物和探针；

所述上游引物是：5’-TTGCTGTTCTGTCCTATCGC-3’；

所述下游引物是：5’-ATGTTGCATTCTTCAGCCGTCT-3；

所述探针是：TCCCATGAAGTCGACCACCTGTTTCCTC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1d T/TCACTGTCA-C3 Spacer。

2.如权利要求1所述的弓形虫核酸快速检测引物组，其特征在于，所述上、下游引物和探针可以是与权利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列碱基互补的序列。

3.弓形虫核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下内容：

(1)裂解液；

(2)稀释液；

(3)含引物的冻干酶管；所述引物为检测弓形虫基因组B1基因序列的上、下游引物和探针；

所述上游引物是：5’-TTGCTGTTCTGTCCTATCGC-3’；

所述下游引物是：5’-ATGTTGCATTCTTCAGCCGTCT-3；

所述探针是：TCCCATGAAGTCGACCACCTGTTTCCTC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1d T/TCACTGTCA-C3 Spacer；

(4)阳性对照品；

(5)阴性对照品。

4.如权利要求3所述的弓形虫核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含0.1-2M的KAc 100μL、0.1-2M的KOH 120μL、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 250μL、水30μL。

5.如权利要求3所述的弓形虫核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液的成分如下：每80ml稀释液中含0.1-2M的MgAc₂ 1.12mL、0.1-2M的KAc 1.20mL、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 4.00mL、1-50％的PEG8K 12.00mL、水61.68mL。

6.如权利要求3所述的弓形虫核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μL DNA解旋酶259μL、100～1000ng/μL单链DNA结合蛋白178μL、10-100ng/μL DNA聚合酶75μL、1-10ng/uL ATP再生蛋白75μL、1-30ng/μL DNA限制性内切酶200μL、1-30ng/μL辅助蛋白30μL、1-100μM上游引物2.5μL、1-100μM下游引物2.5μL、1-20μM探针15.5μL、0.1-2M磷酸肌酸钠115μL、10-100mM ATP1 15μL、1-50mM dNTP 20μL、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40ul、1-5％海藻糖8μL、KAc 0.02g。

7.如权利要求3所述的弓形虫核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为无RNase水空白对照。

8.如权利要求3所述的弓形虫核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含目的基因序列的质粒，浓度是1pg/μL。

9.弓形虫核酸快速检测方法，其特征在于，所述弓形虫核酸快速检测方法采用权利要求3所述的弓形虫核酸快速检测试剂盒，所述弓形虫核酸快速检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；

所述弓形虫核酸快速检测方法包括以下步骤：

(1)取样本适量，加入到500μL裂解液中，充分搅拌混匀，室温放置2-3分钟；

(2)取上步得到的样品裂解液20μL，加入到稀释液中，颠倒混匀8-10次；

(3)取20μL上步得到的混合液加入含引物的冻干酶管中，充分复融；

(4)将复融的冻干酶管放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；

(5)结果分析。

10.如权利要求9所述的弓形虫核酸快速检测方法，其特征在于，所述样本包括但不限于待测犬猫的血、粪便、胸腹腔渗出液、脑脊液、房水。