[发明专利]一种对引物测序的方法

说明书

本发明提供了一种对引物测序的方法，包括以下步骤：以引物Z和引物Y2作为PCR引物对，将质粒模板DNA经PCR扩增出模板DNA1；以引物X和引物Y2作为PCR引物对，将模板DNA1经PCR扩增出待测DNA2；使用引物Y2对待测DNA2进行Sanger法测序，即测得引物X的序列；其中，引物X为待测序的引物；引物Y2为一条已知的通用引物；引物Z由引物X的3'端连接引物Y1构成，引物Y1为另一条已知的通用引物。该方法既能识别待测序的引物的序列长短与总分子量，又能精确地鉴定待测序的引物的序列中的每一个碱基，其检测结果百分百准确；该方法的各步骤操作简单；因此，所述对引物测序的方法具有广阔的应用前景，例如可用于药物研发、生物诊断试剂研发、基因工程等相关技术领域。

技术领域

本发明涉及基因检测鉴定技术领域，特别涉及一种对引物测序的方法。

背景技术

引物(primer)，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺y三酯法，该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

现有技术中，固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：

1)用三氯乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

2)将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5'-羟基发生缩合反应；

3)由于无法保证百分之百的5'-羟基都参与缩合，可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2％)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；

4)在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上；重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基连接完成；合成过程中可以监控脱下的保护基团DMT的颜色可以初步判定合成效率。

在此基础上，为了确定人工合成的引物序列的碱基排列是否正确，现有技术中的引物检测方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)，毛细管凝胶电泳法(CGE)，以及质谱分析(MS)。其中，HPLC是一种高效的分析寡核苷酸的方法；CGE是一种将凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳，基于尺寸排阻机理，可实现单核苷酸分离，可用于测定寡核苷酸纯度，分辨率高，定量准确；MS是用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片)按它们的质荷比分离后进行检测的方法，MS能够精确地测定引物的分子量大小。

然而，事实上，上述各方法中都存在不容忽视的技术缺陷，例如，虽然质谱能够精确检测序列的总分子量，却也仅能知道所检测引物的总分子量，而无法识别其碱基序列排列顺序，更不能识别个别碱基的突变；又如，HPLC和CGE可检测引物主片段所占比例，但是主要是针对引物的纯度进行检测，无法识别序列的长短及具体的碱基排列。因此，现有技术中尚未提供一种能够精确鉴定合成引物的碱基序列的方法。

发明内容

为了克服现有技术中存在的种种技术缺陷，本发明旨在提供一种全新的对引物本身进行测序的方法，该方法既能识别序列的长短与总分子量，又能精确鉴定碱基序列(核苷酸序列)的排列顺序。

具体地，本发明提供了一种对引物测序的方法，其包括以下步骤：