[发明专利]氟苯尼考及氟苯尼考胺抗原、抗体及其同时检测酶联免疫分析方法

权利要求书

1.一种氟苯尼考和氟苯尼考胺的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.包被：将1mg/mL的包被原用包被缓冲液稀释1000倍，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜；

所述包被原为氟苯尼考与载体蛋白的偶联物，其结构如下：所述载体蛋白为卵清蛋白，所述包被原制备方法如下：将10.67mg氟苯尼考半抗原溶于0.25mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入8.11mg的N,N’-羰基二咪唑，37℃搅拌2h，记为A液；将13.41mg载体蛋白OVA溶于3mL 0.01mol/L PBS中，记为B液，搅拌下将A液缓慢滴入B液中，滴加时间控制在10min左右，4℃搅拌反应72h；4℃下PBS溶液透析3天，得到氟苯尼考人工包被原，分装于1mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用；

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板2次，每孔加洗涤液300μL，甩干；

S3.封闭：每孔加入120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干，倒置于37℃烘箱中1h备用；

S4.加样及孵育：每孔加入50μL稀释一定倍数的抗体和50μL药物稀释液；震荡混匀，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液300μL，甩干；抗体稀释倍数为1:8000；

所述抗体是以半抗原FFD偶联钥孔血蓝蛋白得到的人工抗原FFD-KLH作为免疫原，通过动物免疫而获得的，所述半抗原FFD的结构如下：所述免疫原的制备方法为：将5mg FFD半抗原溶于0.2mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入4.78mg N,N-二环己基碳二亚胺和2.65mg N-羟基琥珀酰亚胺，4℃下搅拌反应过夜，离心后取上清液记为A液，将14.6mg载体蛋白KLH溶于4mL 0.01mol/L PBS中，记为B液，搅拌下将A液滴入B液中，4℃反应12h，反应完离心取上清，4℃下PBS溶液透析3天，得到氟苯尼考人工免疫原，以1mg/mL的浓度分装于1mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用；

S5.加入二抗：每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗兔IgG，37℃水浴箱中反应30min，洗板5次，甩干；

S6.显色：每孔加入显色液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL终止液10％H₂SO₄；

S7.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值；

S8.计算：用Origin8.6的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC50值。