[发明专利]PD1单链抗体在大肠杆菌中的制备方法

说明书

本发明提供新型PD1单链抗体在大肠杆菌中的制备方法。PD1单链抗体片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备方法包括：将N端带有信号肽的PD1单链抗体的氨基酸序列的基因克隆于带有启动子的表达载体内构建重组表达载体；将所得的重组表达载体转座至感受态细胞中，筛选重组菌斑，提取重组质粒，并将其转染至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组细菌进一步筛选，放大培养细菌以表达PD1单链抗体白，离心收集含PD1单链抗体蛋白的菌泥；将所得菌泥破碎后，分离、纯化得到PD1单链抗体片段。

技术领域

本发明涉及新型PD1单链抗体在大肠杆菌表达系统中的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤免疫治疗性单抗抗体是近年来肿瘤治疗的突破性发现，其中PD1抗体是第二个获FDA批准的免疫治疗肿瘤的单克隆抗体药物，被称为癌症治疗的突破型发现，其典型的代表包括Nivolumab(BMS)和Keytruda(Merk)。PD1程序性死亡受体是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，功能是抑制细胞的激活，这是免疫系统的一种正常的自稳机制，因为过度的T/B细胞激活会引起自身免疫病，所以PD1是我们人体的一道护身符。肿瘤细胞所具有的逃避免疫系统的能力，是通过在其表面产生的程序性死亡配体(PD-L1)结合到T细胞的PD-1蛋白上实现的。机体内的肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制而不能发现肿瘤以至于不能向免疫系统发出需要攻击肿瘤和杀伤肿瘤细胞的治疗。PD1抗体是针对PD1的一种抗体蛋白，使得前两种蛋白不能发生结合，阻断这一通路，部分恢复T细胞的功能，使这些细胞能够继续杀伤肿瘤细胞。关于PD1抗体的临床疗效，目前已有的结果包括：PD1抗体能控制50％皮肤癌的癌症进展，治愈10％左右的皮肤癌病人；也能控制24％具有顽固非小细胞肺癌的病人。百时美施贵宝最新的临床试验显示他们的PD1单抗Nivolumab能使41％的患者存活超过一年。Keytruda治疗恶性胸膜间皮瘤疾病控制率高达76％，Keytruda可以提高晚期黑色素瘤的整体生存率和无进展生存率等等。

发明内容

新型PD1单链抗体由本申请人开发，是属于IgG抗体分子。新型PD1单链抗体(其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)是单体，不包含F_C片段，能特异性地与PD-L1受体结合从而阻断PD1/PD-L1信号通路。PD1单链抗体分子量很小，只有25kDa，因其相对分子质量小、有高度确定的完整性结构和免疫原性低等优点成为IgG类抗体生产和改造的首选。

大肠杆菌E.coli是第一代重组蛋白药物所用的宿主。因为成本低，易控制等优点，而在第一代蛋白药物中广发使用。然而目前还没有将大肠杆菌E.coli用于表达新型PD1单链抗体的药物上市的报道。本发明的另一目的在于提供一种大肠杆菌表达系统中表达获得重组单链PD1抗体。本发明人经研究发现，通过利用大肠杆菌作为宿主进行表达，可获得具有生物活性的重组PD1单链抗体。

在此，本发明提供一种全新的PD1单链抗体的制备方法，包括：

(a)将N端带有信号肽的PD1单链抗体的氨基酸序列的基因克隆于带有启动子的表达载体内构建重组表达载体；

(b)将所得的重组表达载体转座至感受态细胞中，筛选重组菌斑，提取重组质粒，并将其转染至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组细菌进一步筛选，放大培养细菌以表达PD1单链抗体白，离心收集含PD1单链抗体蛋白的菌泥；

(c)将所得菌泥破碎后，分离、纯化得到PD1单链抗体片段。

较佳地，将所得菌泥破碎后，首先使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶液，然后色谱柱纯化，即可得到PD1单链抗体片段。