[发明专利]一种反刍专用复合微生态制剂的制备方法

权利要求书

1.一种反刍专用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括如下具体步骤：

第一步，菌种活化：

将4℃斜面保存的芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母活化，将其分别划线于相应固体培养基上，25-37℃，培养20-48h；

第二步，种子培养：

挑取活化的菌落，将各菌株接种于各自种子培养基进行种子培养，25-37℃、200r/min培养18-24h；

第三步，上罐发酵培养：

将一级种子液按5-10％接种量接入一级400L发酵罐中，发酵培养基为下述培养基，通风比1:1，转速100r/min，25-37℃，培养8h后转入5t二级发酵罐，培养16h后转入70t三级发酵罐，培养24h后收集菌液；

第四步，提取干燥：

①将收集后的芽孢杆菌菌液添加碳酸钙5％-7％，磷酸二氢钠2％-3％，氯化钙2.5-3％絮凝剂絮凝。然后使用孔径为500目的滤布进行板框过滤，收集滤饼。将滤饼进行低温干燥(60-80℃)，烘干后粉碎，制得菌粉；

②将收集后的嗜酸乳杆菌加入5％海藻糖保护剂进行真空冷冻干燥，收集菌粉；

③将收集后的酿酒酵母加入7％蔗糖保护剂进行真空冷冻干燥，收集菌粉；第五步，稀释涂布平板计算活菌数：取1g各单菌菌粉进行稀释涂布平板计算活菌数。

第六步，混合：

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母按照一定比例复配，以麦饭石为载体，进行混匀制得复合微生态制剂。

第七步，包装：

采用无菌密封袋包装复合微生态制剂。

2.根据权利要求1所述的一种反刍专用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的第一步中，

所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌；

所述芽孢杆菌的固体培养基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，琼脂18，pH 7.2；

所述嗜酸乳杆菌的固体培养基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，葡萄糖20，吐温801mL，柠檬酸二铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，琼脂18，pH 6.2；

所述酿酒酵母的固体培养基(g/L):酵母浸粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，琼脂18，pH 6.2；

菌种来源：

枯草芽孢杆菌：中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10071；

地衣芽孢杆菌：中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10037；

凝结芽孢杆菌：中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号21736；

嗜酸乳杆菌：中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号6074；

酿酒酵母：中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号31015。

3.根据权利要求1所述的一种反刍专用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的第二步中，

所述芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母种子培养基同第一步固体培养基，只是不加琼脂。

4.根据权利要求1所述的一种反刍专用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的第三步中，

所述芽孢杆菌的发酵培养基(g/L):蛋白胨30-50，酵母浸粉25-40，葡萄糖3-5，氯化钠0.4-1，玉米淀粉2-4，玉米浆干粉2-3，豆饼粉4-5，碳酸钙1-1.5，磷酸氢二钾5-10，硫酸镁1-2，中性蛋白酶10-20，中性淀粉酶5-10，硫酸锰2-3，消泡剂10-30，pH7-7.2；

所述嗜酸乳杆菌的发酵培养基(g/L)：蔗糖20-40，酵母浸膏40-60，无水乙酸钠5-10，磷酸氢二钾1-3，柠檬酸氢二铵2-4，硫酸镁0.5-1.0，硫酸锰0.1-0.3，吐温-801-3mL，碳酸钙1-3；

所述酿酒酵母的发酵培养基(g/L)：葡萄糖15-30，酵母浸粉10-20，硫酸铵4-8，pH 6.2。